Estudo Comparativo Da Ação Da Toxina Botulínica Tipo A E .
ARTIGO ORIGINAL296Estudo comparativo da ação da toxinabotulínica tipo A e da crotoxina sobreas células satélites da musculaturaextrínseca ocular em modelo animalA comparative study of the effects of type A botulinum toxinand crotoxin on satellite cells of extraocular muscles in rabbitsMarta Halfeld Ferrari Alves Lacordia1, Geraldo de Barros Ribeiro2, Henderson Celestino de Almeida3 , CarlosHenrique Reis de Araújo Silva4, Maria do Carmo Jordão Coelho5, Raul Fernando Binato Lamim6RESUMOObjetivos: Avaliar o efeito da toxina botulínica do tipo A e da crotoxina na ativação de célulassatélites das fibras musculares de retos superiores de coelhos. Métodos: Os músculos retossuperiores do olho direito de 29 coelhos machos albinos neozelandeses foram inoculados comtoxina botulínica do tipo A ou com crotoxina, em diferentes doses. Os músculos retos superiores contralaterais de cada animal foram inoculados com solução salina em volume igual aodas toxinas. Os animais foram sacrificados 12, 18 ou 25 dias após as aplicações. Os olhos foramenucleados e cada músculo foi preparado para análise imunoistoquímica, com marcadores decélulas satélites. Foi realizada contagem dos núcleos corados pelos marcadores a cada cemmiofibras. Resultados: A aplicação de toxina botulínica e de crotoxina provocou um aumentono número de células satélites ativadas e em proliferação nos músculos retos superiores. Umamaior ativação foi observada após a aplicação de crotoxina, embora, estatisticamente, a diferença do efeito de ativação entre os grupos botoxina e crotoxina não tenha sido significativa.Nos grupos botoxina e crotoxina, não houve correlação estatisticamente significativa entre adose e o volume aplicados e o aumento na ativação das células. O tempo de vida após aaplicação contribuiu para o aumento das células ativadas nos grupos. Conclusão: A observação de maior desorganização na estrutura muscular e de sinais de regeneração mais evidentesno grupo crotoxina parece estar correlacionada ao aumento de células satélites ativadas.Descritores: Células satélites de músculo esquelético /efeito de drogas; Toxina botulínica tipoA; Crotoxina; Estrabismo; Fibras musculares/efeito de drogas.1Doutora em Oftalmologia pela Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG - Belo Horizonte (MG),Oftalmologista e Chefedo Serviço de Oftalmologia do Hospital Universitário da Universidade Federal de Juiz de Fora – UFJF - Juiz de Fora (MG), Brasil.2Doutor em Medicina, Professor Voluntário do Serviço de Estrabismo do Hospital São Geraldo, da Universidade Federal de Minas Gerais– UFMG - Belo Horizonte (MG), Brasil.3Professor Titular e chefe do Serviço de Estrabismo do Hospital São Geraldo, da Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG - BeloHorizonte (MG), Brasil.4Médico veterinário, Diretor da Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade Presidente Antônio Carlos – UNIPAC, Campus VI, Juizde Fora (MG), Brasil.5Professora Adjunta do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Juiz de Fora – UFJF - Juiz deFora (MG), Brasil.6Professor Adjunto do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Juiz de Fora – UFJF - Juiz deFora (MG), Brasil.Trabalho realizado na Universidade Federal de Minas Gerais, na Universidade Federal de Juiz de Fora, na Faculdade de MedicinaVeterinária da Universidade Presidente Antônio Carlos (UNIPAC, Campus VI – Juiz de Fora, MG) e no Departamento de Anatomopatologiada Santa Casa de Misericórdia de Juiz de Fora, MG, sendo apresentado como requisito parcial à obtenção do grau acadêmico de Doutorem Medicina pela Universidade Federal de Minas Gerais.Recebido para publicação em: 18/5/2009 - Aceito para publicação em 12/7/2009Rev Bras Oftalmol. 2009; 68 (5): 296-303
Estudo comparativo da ação da toxina botulínica tipo A e da crotoxina sobre as células satélites da musculatura .INTRODUÇÃOOmúsculo esquelético é um tecido capaz de responder a estímulos fisiológicos (como exercícios intensos) ou a traumas severos através derespostas regenerativas bem organizadas que restauramsua arquitetura em um período de duas semanas (1). Essacapacidade de regeneração é atribuída a uma população de células que foram, em 1961, identificadas e descritas pela primeira vez por Alexander Mauro, em fibramuscular esquelética de rãs. Ele denominou-as célulassatélites (CS) devido à sua localização na periferia dafibra muscular (2). Enquanto o tecido muscular esqueléticoencontra-se livre de agressões, as CS permanecem emum estado não proliferativo, ou seja, em estadoquiescente. Em resposta a estímulos (como um trauma)as CS tornam-se ativas, proliferam-se, expressammarcadores miogênicos, fundem-se a fibras muscularespré-existentes ou a CS vizinhas para formar novas fibrasmusculares (1).Ao contrário da musculatura esquelética, que épós-mitótica, os músculos oculares extrínsecos (MOE)apresentam-se em contínua renovação celular devidoàs CS. McLoon e Wirtschafter descreveram cerca de 2%a 4% de CS positivas para Myo D (myogenicdetermination gene D) em fibras da musculatura ocularexterna de coelhos, macacos e humanos adultos e semsinais de trauma. Observaram também, em ratos e coelhos, a adição de novos mionúcleos às fibras pré-existentes. Isso sugere que os MOE estão em contínua renovação, o que não ocorre, por exemplo, em músculoesquelético adulto dos membros (3-6).O estrabismo é um desalinhamento dos olhos,freqüentemente associado à hiper ou hipofunção deMOE. O objetivo do tratamento cirúrgico do estrabismoé equilibrar as forças geradas pelos MOE, de maneiraque, na presença de impulsos motores eferentes anormais, o alinhamento binocular normal possa ser alcançado ou mantido. A cirurgia compromete a dinâmicamuscular normal e, inevitavelmente, provoca cicatrizes,incomitâncias e, ocasionalmente, estrabismos secundários (7, 8).A toxina botulínica do tipo A, aprovada para usoclínico há mais de uma década, tem sido utilizada eficazmente para o enfraquecimento de músculoshiperfuncionantes no estrabismo de adultos e crianças.Porém, a necessidade de se descobrir um tratamentofarmacológico para o estrabismo, que não cause enfraquecimento muscular permanente, mas que tenha uma297duração maior que a da toxina botulínica, estimula acomunidade científica a pesquisar novas substâncias.Estudos recentes verificaram que a crotoxina foi capazde induzir uma paralisia transitória em músculo retosuperior de coelhos; além disso, sua ação e seu efeitoforam semelhantes aos da toxina botulínica do tipo A. Oconhecimento da participação das células satélites nofuncionamento dos MOE, assim como os métodos de secontrolar a ativação dessas células, têm se tornado umcampo de estudo de grande interesse (9-11).O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito datoxina botulínica do tipo A e da crotoxina na ativação deCS das fibras musculares de músculos retos superioresde coelhos.MÉTODOSEste estudo experimental e longitudinal foi realizado no biotério da Faculdade de Medicina Veterináriada Universidade Presidente Antônio Carlos (UNIPAC)– Juiz de Fora, Minas Gerais, e foi aprovado pelo Comitêde Ética em Experimentação Animal (CETEA/UFMG).Foram utilizados 29 coelhos machos albinos, da raçaNova Zelândia, com peso variando de 1,5 kg a 2,5 kg,clinicamente sadios, provenientes da Fazenda Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais (Igarapé– MG). A pesquisa foi conduzida obedecendo-se aos critérios recomendados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e respeitando a Lei Federal Brasileira número 6 638, de maio de 1979. Os animais foram mantidos em gaiolas suspensas, com água eração específica para a espécie ad libitum e divididosaleatoriamente em dois grupos: botoxina (GB) ecrotoxina (GCrtx).Após a instilação de colírio anestésico decloridrato de benoxinato a 0,4% (oxibuprocaína) no sacoconjuntival de cada olho direito, colocou-se umblefarostato. Usando-se uma pinça denteada para elevar a conjuntiva, uma agulha acoplada à seringa de insulina (BD Plastipak – Becton Dickinson Ind. Cirúr. Ltda.,Curitiba – PR), contendo ou Botox (AllerganPharmaceuticals Ltd – Westport, Irlanda) ou crotoxina(cedida pela Divisão de Imunológicos da FundaçãoEzequiel Dias de Belo Horizonte – Minas Gerais[FUNED]), foi introduzida transconjuntivalmente e penetrada no músculo reto superior, a aproximadamente 4mm da inserção muscular. A toxina foi injetada lentamente. O mesmo processo foi executado no olho esquerdo com a aplicação de solução salina em igual volume.Rev Bras Oftalmol. 2009; 68 (5): 296-303
298Lacordia MHFA, Ribeiro GB, Almeida HC, Silva CHRA, Coelho MCJ, Lamim RFBO QUADRO 1 mostra as doses de toxina botulínica ede crotoxina aplicadas em cada coelho. O coelho 5 apresentava atrofia ocular esquerda, por trauma perfurante,não tendo sido, portanto, aplicada a solução no músculoreto superior de tal olho.Após a aplicação das toxinas e da solução fisiológica, os coelhos foram examinados diariamente paraobservação de existência de efeitos adversos locais esistêmicos. Não houve mudança comportamental. Observou-se ptose palpebral moderada no olho direito doscoelhos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23 e 24 e ptose discreta nos coelhos 11, 12, 13, 14, 25, 26,27, 28 e 29, com duração média de cinco dias. No olhoesquerdo de todos os coelhos, não houve ptose palpebral.Houve sinais de hiperemia conjuntival em todos os coelhos no primeiro dia após a aplicação, mas tais sinaisdesapareceram, na maioria dos animais, no terceiro apósa aplicação. Não foi observada secreção conjuntival.Os animais foram sacrificados por médico veterinário, nos momentos estabelecidos (12, 18 ou 25 diasapós as aplicações), com tiopental sódico (Thiopentax – Cristália), na dosagem de 20 mg/kg, seguido de injeção intracardíaca de cloreto de potássio a 10%. Os coelhos 1, 6, 11, 15, 20 e 25 foram sacrificados no 12º dia apósas aplicações; os coelhos 2, 3, 7, 8, 12, 16, 17, 21, 22, 26 e27, no 18º dia; os coelhos 4, 5, 9, 10, 13, 14, 18, 19, 23, 24, 28e 29 no 25º dia.Posteriormente, os olhos foram cuidadosamenteenucleados, mantendo-se os músculos retos superioresintactos. Os globos oculares foram colocados em frascosnumerados, com formol tamponado a 10%. Os músculosretos superiores foram desinseridos dos globos oculares.Cada músculo foi colocado em cassete plástico, identificado com o mesmo número contido no frasco de origeme levado para processamento histológico. Lâminas foram montadas, preparadas e coradas com hematoxilinaeosina e marcadores de células satélites Myo D e PCNA(proliferating cell nuclear antigen).As lâminas tiveram suas identificações recobertasdurante a análise anátomo-patológica e também durante a contagem das CS, realizada por patologista experiente. Foram examinadas em microscópio da marca Nikoncem miofibras escolhidas ao acaso, com aumento de milvezes (ocular de dez vezes e objetiva de cem vezes); foifeita a contagem dos núcleos positivos para o Myo D epara o PCNA, bem como a contagem do total de CS(núcleos positivos e negativos para os marcadores).Os dados foram analisados, calculando-se asmédias aritméticas, o desvio padrão e a amplitude daRev Bras Oftalmol. 2009; 68 (5): 296-303variação. As variáveis independentes foram representadas pelas substâncias injetadas no músculo reto superiordo olho direito dos coelhos, bem como pelos co-fatorestempo de vida após a aplicação, volume aplicado e dosedas substâncias. As variáveis dependentes foram representadas pela porcentagem de núcleos de CS ativados.A avaliação do efeito foi realizada pela medidada ativação dos núcleos de células satélites, pelos doismarcadores, segundo o cálculo:% núcleos ativados nº de núcleos ativados/100miofibras/total de núcleos/100 miofibrasO modelo estatístico empregou a comparaçãode médias de porcentagem de núcleos de CS ativadosentre os grupos definidos pelo tipo de substância. Paraavaliar a diferença das médias de porcentagem de núcleos de CS ativados entre os grupos de substâncias, utilizouse o teste de ANOVA, quando foram atendidos os pressupostos de normalidade e homogeneidade das variâncias.No caso do não atendimento dos pressupostos, foi utilizado o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. Para avaliação da normalidade, foi utilizado o teste de KolmogorovSmirnov. Para avaliação da homogeneidade dasvariâncias, utilizou-se o teste de Levene. Para avaliar aexistência de correlação entre o percentual de núcleosativados, as doses, os volumes e os dias de vida após aaplicação, foram utilizados o coeficiente de Pearson e ainspeção do diagrama de dispersão. A interferência dosco-fatores nas associações foi avaliada com o testeANOVA de dois critérios, quando atendidos os pressupostos dos testes paramétricos. Todos os resultados foramconsiderados significativos, em um nível de significânciade 5% (α 0,05). Valores de p entre 0,05 e 0,10 foramconsiderados marginalmente significativos.RESULTADOSDos 57 músculos retos superiores de coelhos estudados, 14 receberam aplicação de toxina botulínica (grupo botoxina), 15 receberam crotoxina (grupo crotoxina)e 28 receberam solução salina (grupo controle). A tabela 1 esquematiza os percentuais de núcleos marcadospelo Myo D e pelo PCNA nos grupos estudados. Após arealização dos testes para a análise entre os grupos dospercentuais de contagem dos núcleos marcados respectivamente pelo Myo D e pelo PCNA, notou-se que adiferença entre os efeitos mensurados foi estatisticamente significativa (p 0,000). Não houve diferença estatis-
Estudo comparativo da ação da toxina botulínica tipo A e da crotoxina sobre as células satélites da musculatura .299Quadro 1Toxina botulínica e crotoxina aplicadas no m.RS do OD dos coelhos 1 a 29Identificaçãodos coelhosToxina aplicadae dosagemVolume aplicadoData da aplicaçãoMúsculo emque foi 6272829Botox 10 UBotox 10 UBotox 10 UBotox 10 UBotox 10 UBotox 5 UBotox 5 UBotox 5 UBotox 5 UBotox 5 UBotox 2,5 UBotox 2,5 UBotox 2,5 UBotox 2,5 UCrotoxina10 UCrotoxina10 UCrotoxina10 UCrotoxina10 UCrotoxina10 UCrotoxina 5 UCrotoxina 5 UCrotoxina 5 UCrotoxina 5 UCrotoxina 5 UCrotoxina 2 UCrotoxina 2 UCrotoxina 2 UCrotoxina 2 UCrotoxina 2 U0,5 ml0,5 ml0,5 ml0,5 ml0,5 ml0,25 ml0,25 ml0,25 ml0,25 ml0,25 ml0,1 ml0,1 ml0,1 ml0,1 ml0,5 ml0,5 ml0,5 ml0,5 ml0,5 ml0,25 ml0,25 ml0,25 ml0,25 ml0,25 ml0,1 ml0,1 ml0,1 ml0,1 ml0,1 0625/11/200625/11/200625/11/200625/11/2006RS OD*RS ODRS ODRS ODRS ODRS ODRS ODRS ODRS ODRS ODRS ODRS ODRS ODRS ODRS OD*RS ODRS ODRS ODRS ODRS ODRS ODRS ODRS ODRS ODRS ODRS ODRS ODRS ODRS OD*Reto superior do olho direitoTabela 1Percentuais de núcleos marcados pelo Myo D e pelo PCNAnos grupos controle, botoxina e rmínimoValormáximoMyoD(p 1,2013,1214,0114,430,123,451,866,971,0PCNA (p 0,7016,8011,4712,223,735,754,372,073,4Rev Bras Oftalmol. 2009; 68 (5): 296-303
300Lacordia MHFA, Ribeiro GB, Almeida HC, Silva CHRA, Coelho MCJ, Lamim RFBticamente significativa entre os grupos botox e crotoxinaem relação aos núcleos corados pelo Myo D (p 0,374)e pelo PCNA (p 0,485). A tabela 2 demonstra que asrelações entre a dose aplicada e a resposta e o volumeaplicado e a resposta não foram significativas em nenhum dos grupos analisados. A tabela 3 demonstra que arelação entre os dias de vida após a aplicação foi estatisticamente significativa em todos os grupos analisados.As lâminas com cortes histológicos dos músculosretos superiores dos grupos deste estudo foram tambémanalisadas com coloração de hematoxilina-eosina. Nosgrupos controle, botoxina e crotoxina, as alterações musculares observadas no músculo reto superior foram focais,ou seja, encontradas no local da aplicação das substâncias.DISCUSSÃOChristiansen et al. (2000) injetaram ricin-mAb 35no músculo reto superior de coelhos, com o objetivo dedeterminar os efeitos histológicos e ultra-estruturais nosmúsculos. Verificaram lesões focais dose-dependentes,processos inflamatórios auto-limitantes e significanteperda de fibras musculares. Notaram uma lenta regeneração das miofibras (7). Em 2003, Christiansen et al. voltaram a estudar os efeitos dessa imunotoxina na forçamuscular de músculo extrínseco ocular. Concluíram queesse lento processo de regeneração poderia explicar alonga duração da ação da ricin-mAb 35. Demonstraramatravés de estudos histológicos que a aplicação da substância resultava em lesão citotóxica discreta, com boapreservação das miofibras periféricas no local da injeção. Sugeriram que a ricin-mAb poderia ser uma alternativa para o retrocesso cirúrgico e também uma opçãomais duradoura que a toxina botulínica no tratamentofarmacológico do estrabismo (12).Ugalde et al. (2005) observaram que a paralisiados MOE induzida por toxina botulínica em olhos decoelhos resultou em aumento da ativação de CS a curtointervalo de tempo, em comparação com olhos em quehavia sido injetada solução salina (13).Tabela 2Percentuais de núcleos corados pelo Myo D e pelo PCNA nos grupos,de acordo com os volumes e nimoValormáximoBotoxinaMarcadorM)QD(p 0,864)*0,l0ml (2,5 U)0,25 ml(5 531,1030, X 58f)766,8764,65BotoxinaMarcadorPCNA(p 0,761)**0,l0ml (2,5 U)0,25 ml(5 823,6627,7370,5472,0568,01CrotoxinaMarcadorM)QD(p 0,936)*0,l0ml(2 U)0,25 ml(5 U)0,50 ml (1 64,9571,0269,13CrotoxinaMarcadorPCNA(p 0,852)**0,l0ml(2U)0,25ml(5U)0,50 ml (1 3,3864,4470,61ControleMarcadorM)QD(p adorPCNA(p 7,755,8612,1824,1332,1742,4848,3054,27ANOVA; ** Teste de Kruskal-WallisRev Bras Oftalmol. 2009; 68 (5): 296-303
Estudo comparativo da ação da toxina botulínica tipo A e da crotoxina sobre as células satélites da musculatura .Este estudo confirma tais relatos, demonstrandohaver um aumento significativo na ativação das CS apósa utilização da toxina botulínica e, de forma um poucomais acentuada, após a aplicação da crotoxina. O estudohistológico das fibras musculares dos grupos botoxina ecrotoxina revelou sinais de regeneração, sem apresentar sinais significantes de atrofia muscular. Demonstroutambém que as lesões foram focais. Ao contrário do quefoi demonstrado por Christiansen et al., verificou-se quea dosagem das toxinas não foi tão importante no acréscimo das CS. O volume de solução salina ou de toxinaaplicado também não influenciou no aumento das CS.Os animais sacrificados mais tardiamente apresentarammaior aumento na ativação das CS e pouco desarranjoda arquitetura das fibras musculares.Porter et al. demonstraram que as alteraçõeshistológicas causadas pela toxina botulínica são reversíveis (14). Supõe-se que o aumento na ativação das CS es-301teja diretamente relacionado à regeneração das fibras.Neste estudo, observou-se, no exame histológicodo grupo crotoxina, maior agressão na estrutura das fibras e sinais de regeneração mais evidentes, o que poderia estar correlacionado com o aumento de CS ativadas.Quando foram aplicadas 10 U de toxinas, o grupocrotoxina ainda apresentou alterações histológicasmarcantes após 26 dias (núcleos reativos e fibras emnecrose); já no grupo botoxina a arquitetura das fibrasmusculares foi reestruturada. Acredita-se que o processode regeneração das fibras musculares após a aplicaçãoda crotoxina seja mais lento que após a aplicação da toxina botulínica, o que poderia explicar a ação mais duradoura da crotoxina. En
Estudo comparativo da ação da toxina botulínica tipo A e da crotoxina sobre . capacidade de regeneração é atribuída a uma popula-ção de células que foram, em 1961, identificadas e des- . os de CS ativados entre os grupos de substâncias, utilizou-se o teste de ANOVA, quando foram atendidos os pressu- .
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