Morts Cellulaires Et Cancer - L2 Bichat 2012-2013

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Module Optionnel Médecine MoléculaireMorts cellulaires et CancerMorgane Le Brasmorgane.le bras@univ-paris-diderot.frHôpital Saint LouisINSERM U944-CNRS UMR 7212

Cancer Maladie génétique/épigénétique Terme général: développement etprolifération incontrôlées des cellulestransformées Anomalies acquises (qui n’existent pas aucours du développement)

Facteurs de promotion et d’initiation tumorale Facteurs endogènes:· genetic factors (heredity, chromosomal alterations)· hormonal factors (hormone-dependent tumors)· immune factors (immunodepressed patients )· oncogene activation· loss of tumor suppressor genes· age Facteurs exogènes :· ionising radiations (X rays)· accidental irradiations (Tchernobyl )· chemical carcinogens (metals, benzol, tobacco)· oncogenic viruses

Un processus multi-étapes

Qu’est-ce qu’une cellule cancéreuse? Immortalisation Phénomène irréversible Prolifération « infinie » Réactivation télomerase Implication virale Accumulation d’anomalies génétiques

Qu’est-ce qu’une cellule cancéreuse? Immortalisation Transformation Perte d’équilibre entre molécules pro/antiprolifération Foyers/monocouches Rôle des oncogènes & suppresseur de tumeurs Cellules tumorales

Qu’est-ce qu’une cellule cancéreuse? Immortalisation Transformation Progression Promotion tumorale expression phénotypiquedes modifications génotypiques Agents génotoxiques augmentent la progressiontumorale Aberrations chromosomiques & aneuploïdie

Qu’est-ce qu’une cellule cancéreuse? Immortalisation Transformation Progression Migration

Un processus multi-étapesHanahan & Weinberg, Cell 2000

Morts cellulaires et cancer Introduction: Les différents types de mort cellulaire––––L’apoptoseL’autophagieLa nécroseEt toutes les autres

Les différents types de mort cellulaireApoptose (type I): Kerr et al, 1972 Critères FragmentationADN

Les différents types de mort cellulaireApoptose (type I): Critères morphologiques

Apoptosis (Programmed Cell Death) Mort génétiquement contrôlée Processus conservé au cours de l’évolution Indispensable au cours du développement–Au cours du développement chez Caenorhabditis elegans (131 cellules sur1089 meurent)–durant la métamorphose chez les insectes (Drosophila melanogaster) et lesamphibiens Indispensable pour l’homéostasie cellulaire–post-natal: rôle important dans le système nerveux et le système immunitaire–Cellules surnuméraires ou endommagées (dommages génotoxiques,infection virale )

L’apoptose dans les pathologies humainesAugmentation del’apoptoseDiminution de l’apoptoseSIDAMaladies neurodégénérativesMaladies autoimmunesCancerDéveloppement de stratégies thérapeutiques pour modulerl’apoptose

Les différents types de mort cellulaire Autophagie (type II): Critères morphologiques:Chromatine nonmodifiéeVacuolesd’autophagie

Les différents types de mort cellulaire Autophagie (type II): Dépend de la susceptibilité à l’apoptose Implique un gène suppresseur de tumeur, beclin 1, délété dans 4075% des cancers ovaire et sein ? In vivo sur le rôle des gènes Atg/Becn1?Extinction entraîne une réduction de la mort cellulaire? L’induction de l’autophagie est parfois réversible Lien avec la protéolyse ( hydrolyse ou dégradation desprotéines par coupure enzymatique)

Les différents types de mort cellulaire Nécrose (type III): Critères morphologiques: Rupture de la membraneplasmique Vésicules intracellulaires Dilatation mitochondriale

Les différents types de mort cellulaire Nécrose (type III): En général, caractérisation de la nécrose par l’absence d’apoptoseou d’autophagie classiques définition par défaut Dans les tumeurs solides, l’hypoxie (déplétion en ATP) ou laprivation de glucose réduit la progression tumorale par nécrose(anaérobiose, production de lactate) La nécrose s’accompagne d’une réponse inflammatoire importante

Nécrose vs Apoptose-ATP ATP

Les différents types de mort cellulaire Et les autres mécanismes, plus atypiques . Catastrophe mitotique: Erreurs de mitoses, micro- et multi-nucléation Dérive vers l’apoptose ou la nécrose Anoikis: Perte d’ancrage cellulaire Excitotoxicity: Spécifiques des neuronesMêmes mécanismesd’induction que l’apoptose Necroptosis: Nécrose génétique contrôlée Dépendante de l’activité sérine/thréonine kinase RIP1 Inhibée par nouveaux agents protecteurs: les nécrostatines

Morts cellulaires et cancer Introduction: Les différents types de mort cellulaire L’apoptose:

Deux voies principales induisent l’apoptoseVoie extrinsèque (type I)Voie intrinsèque (type II)Via récepteurs membranaires:Récepteurs de la famille TNF et FasVia organites cellulaires:Réticulum endoplasmique,mitochondrie, lysosomesStimuli extrinsèquesRécepteurs demortmembranairesMitochondrieStimuliintrinsèques

StimuliextrinsèquesRécepteurs CaspasesinitiatricesApoptosome(caspases 8)(cytochrome c)Effecteursindépendants descaspasesCaspaseseffectrices(caspases 3-6-9)(EndoG, Smac/DIABLO)DNasesDNasesAPOPTOSE

La famille des caspases (1)Des procaryotes aux eucaryotes (plantes, levure, nematodes, arthropodes etvertebrés)Cysteine ASpartate ProteinASES (DEVD motif)zymogènesactivationmaturation1992-1994: Horvitz et al, ced3, ced4 et ced9 genes du nématodemachinerie bien conservée phylogénétiquementC. elegansH.sapiensBAX,CED-9EGL-1Bcl2/Bcl-XLBik, BimBid, cIAPprotéolyse

La famille des caspases (4)Caspases à prodomaine longPro-domainp20Caspases à prodomaine courtp10Caspases initiatricesp20p10Caspases effectricesCaspases 3, 6 & 7Pro-domain DED(Death Effector Domain)Caspases 8 & 10Pro-domain CARD(Caspase Activating Recruitment Domain)Caspases 1, 2, 4, 5, 9, 11 & 12APOPTOSECaspase 14

Activation des caspasesActivation des caspases initiatrices(one step)Activation des caspases effectrices(two steps)Caspases 3, 6 & 7Caspases 8, 9 & 10Clivage protéolytiqueComplexe d’activation-caspases 8 & 10 DISC(voie extrinsèque)-caspase 9 Apoptosome(voie 20p10

Substrats des caspases

Substrats des caspases

Substrats des caspasesActivité protéolytique des caspases:site de clivage spécifiquePARPlaminesa) inactivation d’un substratex: PARP (poly ADP ribose polymerase)inactivée par coupure au site DEVD213Gpar les caspases 3 et 7b) dégradation d’un substratex: réseau des lamines coupépar la caspase 6 (éléments de lamembrane nucléaire)

http://bioinf.gen.tcd.ie/casbah/

La voie extrinsèqueStimuliextrinsèquesRécepteurs CaspasesinitiatricesApoptosome(caspases 8)(cytochrome c)Effecteursindépendants descaspasesCaspaseseffectrices(caspases 3-6-9)(EndoG, Smac/DIABLO)DNasesDNasesAPOPTOSE

La voie extrinsèqueRécepteurs:TNF superfamily of ligands andreceptors with cytosolic signaling domain:Death Domain (DD)FasTNF-related apoptosis–inducing ligand(TRAIL)-R1, (TRAIL)-R2 and TNFR1Protéines adaptatrices:FADDTRADDRIP

La voie FasFas-LFasFADDDISC(Death InducingSignaling Complex)TRANS-DOMINANT INHIBITORSFLIP PROTEINSNH2DEDDEDDEDp10Yp20PRO-CASPASE8COOHACTIVE CASPASE-8p10 p10DEDPRO-DOMAINp20 p20

Cascade d’activation descaspasesCaspase 7Caspase 3FLIP PROTEINSp10Caspase VE CASPASE-8LaminsPARPAPOPTOSEDNA fragmentation

Equilibreapoptose/proliférationTNFTNFR1RIP TRADDTRAF2?PRO-CASPASE-8 O-DOMAINp20p20ACTIVECASPASE-8 -10APOPTOSECaspases 3 &7

Rôle de la voie extrinsèque dans le devenircellulaireFrom Aggarwal,Nature Reviews Immunology, 2003

Apoptose et cancer Introduction: Les différents types de mort cellulaire Gènes et cancer L’apoptose: La voie extrinsèque La voie intrinsèque

La voie intrinsèqueStimuliextrinsèquesRécepteurs CaspasesinitiatricesApoptosome(caspases 8)(cytochrome c)Effecteursindépendants descaspasesCaspaseseffectrices(caspases 3-6-9)(EndoG, Smac/DIABLO)DNasesDNasesAPOPTOSE

La mitochondrie: un intégrateur centralNAD(P)H Céramide, GD3,ROS, NOpalmitatep53CaFamille Bcl-22 p53Protéines virales:(Vpr, Hbx, M11L,vMIA)Petites molécules:Atractyloside,Pro-oxydantsKinases:PKCe, HK, JNK1-Intégration2-Initiation3-Dégradation

La famille From Ranger et al,Nature genetics, 2001

Les facteurs apoptogéniquesBcl-2APOPTOSOMEdATPProCaspase-9 CytD McApaf-1Apaf-1ProCyt cCyt cSmac/DiabloAIF, Endo GCaspase-9XIAPCaspase cascade3, 6 & 7Caspase-9Caspase cascade3, 6 & 7DNA fragmentationAPOPTOSE

StimuliextrinsèquesVue d’ensembleRécepteurs D mCaspasesinitiatricesApoptosome(caspases 8)D m(cytochrome c)Effecteursindépendants descaspasesCaspaseseffectrices(caspases 3-6-9)(EndoG, itochondriale(MMP)

Mécanismes de perméabilisationmembranaire: la controverseA- Formation de pores dans les membranes mitochondriales1/ PTPC : complexe polyprotéique aux sites de contact entreles membranes interne et externe2/ Pores dans la membrane externe : oncogènes etsuppresseurs de tumeur de la famille Bax/Bcl-2B- Rupture de la membrane externe mitochondriale3/ Formation de pores lipidiques dans la membrane externe(rafts lipidiques) 123PTPCCanaux Bax/BakBax/ Bcl-2Pore lipidiqueBax / BakMECyt cMI?

La mitochondrie: un intégrateur central

Apoptose mitochondriale et pathologie

Morts cellulaires et cancer Introduction: Les différents types de mort cellulaire L’apoptose: La voie extrinsèque La voie intrinsèque– Les modèles de perméabilisation membranaire– Le Pore de Transition de Perméabilité (PTP) Les méthodes de détection

Techniques de détection de l’apoptose1/ Microscopie électroniqueBurkitt lymphoma cells after 24htreatment with CD77-Ab

Apoptosis detection1/ At subcellular levelMicroscopy /- stainingEMhematoxylin and eosinCleaved cytokeratin 18

Apoptosis detection1/ At subcellular levelMitochondria parameters:-Morphology (MitoTracker)-Membrane potential (JC-1)Lysosmes parameters:-Morphology: ,IFMonodansylcadaverine (MDC)

Apoptosis detection2/ At « DNA » levelElectrophoresis: « DNA ladder »TUNELApoptosis is increased in CD44v6/v7-/- mice. Apoptotic nuclei weredetected with biotinylated nucleotides followed either bydiaminobenzidine (DAB) detection or by fluorescein-dUTP (FITC).Wittig et al, JEM 2000

Apoptosis detection2/ At « DNA » levelMeasurement of DNA content

Apoptosis detection3/ At membrane levelAnnexin exposure

Apoptosis detection3/ At membrane levelAnnexin exposure

Apoptosis detection4/ At « protein » levelCaspases activationCytochrome c release

Morts cellulaires et cancer Introduction: Les différents types de mort cellulaire L’apoptose: La voie extrinsèque La voie intrinsèque– Les modèles de perméabilisation membranaire– Le Pore de Transition de Perméabilité (PTP) Les méthodes de détection L’autophagie:

Protéolyse: différents systèmesProtéases cytosoliques- Caspases: cystéines-aspartases protéolyse ménagée des protéines cytosoliquesSystème multi-enzymatique (dans le cytosol ou le noyau)- protéasome dégradation totale des protéinesintracellulaires cytosoliques, réticulaires ou nucléairesSystème multi-enzymatique compartimenté (vacuoles lysosomes)- autophagie protéolyse totale protéines intracellulaires- endocytose protéolyse totale des protéinesextracellulaires

Protéolyse et Métabolisme protéiqueQuel système pour quelle fonction?Dégradation spécifique: protéasome- concerne les protéines à durée de vie courte- spécificité déterminée par:- acide aminé N-terminal- séquences d’acides aminés spécifiques (ex: PEST)- modification post-traductionnelle (ex: ubiquitine)Dégradation non spécifique: autophagie- concerne les protéines à durée de vie longue- pas de spécificité apparente connue

DEGRADATION LYSOSOMALE ou AUTOPHAGIEfonctionsNiveau basal renouvellement du contenu cytoplasmique (homéostasiecytoplasmique: protéines , ARN, organites).Situation de carence nutritionnelle favorise la dégradation protéique et fournit des acidesaminés essentiels.

DEGRADATION LYSOSOMALE ou AUTOPHAGIEprocessus de survieAutophagie induite par la carence processus auto-réguléhormonePI3KinasehormoneForte [aa]Faible[aa]mTOR activéAutophagiebasaleSynthèse protéiqueimportantePI3KinasemTOR e

DEGRADATION LYSOSOMALE ou AUTOPHAGIEfonctionsNiveau basal renouvellement du contenu cytoplasmique (homéostasiecytoplasmique: protéines , ARN, organites).Situation de carence nutritionnelle favorise la dégradation protéique et fournit des acidesaminés essentiels.Situation de stress élimination des macromolécules et structures cellulairesaltérées (ex: protéines oxydées, mitochondriesendommagées).Persistance mort cellulaire.

DEGRADATION LYSOSOMALE etmort cellulaire par AUTOPHAGIEInducteurs : Carence alimentaire ou en acides aminés Carence en facteurs de croissance ouhormones Stress intracellulaire (dommage ADN) Drogues ou agents chimiothérapeutiques Infections virales Choc thermiqueInduction maintenue Radiations UV ou γet importante mort cellulaire

DEGRADATION LYSOSOMALE ou AUTOPHAGIE trentaine de gènes appelés Atg (autophagy gene)Implication des Atg dans laformation de minéslibresMAP1-LC3(Atg8)Prot - FYVEClass III PI3K/Beclin 1 (Atg6)

Morts cellulaires et cancer Introduction: Les différents types de mort cellulaire Gènes et cancer L’apoptose: La voie extrinsèque La voie intrinsèque– Les modèles de perméabilisation membranaire– Le Pore de Transition de Perméabilité (PTP) L’autophagie: Comparaison des 2 voies

MORTS CELLULAIREScomparaison des caractéristiquesApoptose Condensation de lachromatine avecfragmentation d’ADN Pas d’ accumulation devacuoles Condensation ducytoplasme Ouverture du pore detransition mitochondrial Activation des caspases BourgeonnementmembranaireAutophagie Condensation partielle dela chromatine possiblesans fragmentation d’ADN Accumulation de vacuolesautophagiques Ouverture possible du porede transition mitochondrial Pas d'activation decaspases Bourgeonnementmembranaire

MORTS CELLULAIREScomparaison des inducteursApoptose Carence alimentaire ouen acides aminés Carence en facteurs decroissance ou hormones Stress intracellulaire(dommage ADN) Drogues ou agentschimiothérapeutiques Infections virales Choc thermique Radiations UV ou γAutophagie Carence alimentaire ouen acides aminés Carence en facteurs decroissance ou hormones Stress intracellulaire(dommage ADN) Drogues ou agentschimiothérapeutiques Infections virales Choc thermique Radiations UV ou γ

Morts cellulaires et cancer Introduction: Les différents types de mort cellulaire Gènes et cancer L’apoptose: La voie extrinsèque La voie intrinsèque– Les modèles de perméabilisation membranaire– Le Pore de Transition de Perméabilité (PTP) L’autophagie: Comparaison des 2 voies Morts cellulaires: la polémique

Mort cellulaire: la polémique Comment reconnaître une cellule morte?Kroemer et al, CDD 2008

Mort cellulaire: la polémique Comment étudier la mort cellulaire?

Mort cellulaire: la polémique Comment étudier la mort cellulaire?Kroemer et al, CDD 2008

Mort cellulaire: la polémique Quel est le point de non retour?Kroemer et al, CDD 2008

Morts cellulaires et cancer Introduction: Les différents types de mort cellulaire Gènes et cancer L’apoptose: La voie extrinsèque La voie intrinsèque– Les modèles de perméabilisation membranaire– Le Pore de Transition de Perméabilité (PTP) L’autophagie: Comparaison des 2 voies Stratégies thérapeutiques

Les stratégies thérapeutiques Réactiver l’apoptose via les acteurs de la voieextrinsèque– TRAIL: très exprimé dans les cellules– ligand de TRAIL– MAbs: HGS-ETR1, HGS-RTR2 (phases I et II)– c-FLIP: réverse la résistance in vitro et réduit le volumetumoral de xénogreffes in vivo– TNF:– TNF-a: toxique, effet sensibilisateur (sarcomes, mélanomes)

Les stratégies thérapeutiques Activer les caspases (initiatrices ou exécutrices)– Peptides synthétiques: Peptides RGD se lient aux intégrines et sont capablesd’interagir et d’activer la caspase-3 En combinaison avec d’autres molécules:RGD paclitaxel cible le récepteur aux aV intégrines(cellules cancéreuses métastatiques)– Molécules naturelles: Apoptin, dérivée d’un virus aviaire Induit les caspases dans les cellules cancéreusesindépendemment de Bcl-2 et p53

Les stratégies thérapeutiques Cibler les régulateurs de caspases: IAPs– Niveau élevé de IAPs mauvais prognostic– 2 voies: bloquer IAPs ou augmenter effet de leursinhibiteurs naturels XIAP antisens: tests précliniques, inhibition tumorale encombinaison avec un traitement chimiothérapeutique Smac/DIABLO: mimétiques qui se lient à XIAP, c-IAPs– 12d: augmente l’apoptose induite par le cisplatine dans descellules de cancer de la prostate (PC-3)– compound 3:synergise l’effet de TRAIL et de TNF-a dans descellules de glioblastome (T98G)

Les stratégies thérapeutiques Cibler les protéines de la famille Bcl-2– Réactiver les membres pro-apoptotiques ouinhiber les membres anti-apoptotiques– Antisense Bcl-2: Phase I ( chimiothérapie) chez des patients atteintsde LAM: la réponse au traitement est corrélée au niveau d’extinctionde Bcl-2 Phase II ( dexamethasone thalidomine) chez despatients atteints de myelome multiple: bonne tolérance à lachimiothérapie Phase III ( chimiothérapie) pour plusieurs types decancers: bénéfice significatif pour des mélanomes métastatiques(suivi 24 mois)

Les stratégies thérapeutiques Cibler les protéines de la famille Bcl-2 (2)– Agoniste de Bcl-2: ABT-737 Inhibition de Bcl-2 et Bcl-XL Allonge la survie , induit une régression tumorale etpermet une guérison fréquente dans des modèlesmurins Bénéfique en combinaison avec traitement( lymphomes ou SCLC)Stratégie anti-Bcl-2 est la plus avancée au niveaucliniqueBientôt adjuvants à la chimio ou radio-thérapie classiques

Les stratégies thérapeutiques Réactiver les fonctions de p53

Les stratégies thérapeutiques Réactiver les fonctions de p53– PRIMA-1 (P53 Reactivation and Induction for a Massive Apoptosis) Restauration de la conformation sauvage de p53:transactivation de Bax, relargage de protéines Bcl-2séquestrée par Bcl-XL In vivo: synergie avec le cisplatine: induction del’apoptose, inhibition de la croissance tumorale et desxénogreffes– RITA Cible les tumeurs avec surexpression de MDM2 Inhibition de l’interaction p53/MDM2: p53 est stable etactive

Les stratégies thérapeutiques Réactiver les fonctions de p53 (2)– Adénovirus p53: ONYX-015 Le virus se réplique uniquement dans les cellules avecune p53 déficiente En phase III: synergie avec cisplatine ou 5-FU ? sur la sélectivité cellulaire?

Les stratégies thérapeutiques Réactiver les fonctions de p53 (3)

Les stratégies thérapeutiques Réactiver les mécanismes de l’autophagie

Les stratégies thérapeutiques Réactiver les mécanismes de l’autophagieARHI, gène suppresseur de tumeurs: Implications cliniques-60% des tumeurs ovariennesavec expression de ARHIdiminuée-période de rémission cliniqueraccourcie- amélioration par drogues proautophagies chimio?

Les stratégies thérapeutiques Réactiver les mécanismes de l’autophagieARHI, gène suppresseur de tumeurs: Implications cliniques-60% des tumeurs ovariennesavec expression de ARHIdiminuée-période de rémission cliniqueraccourcie- amélioration par drogues proautophagies chimio?

La mort cellulaire, en résumé

Nature Reviews Molecular Cell Biology (November 2004) APOPTOSIS PATHWAYS AND DRUG TARGETS

Module Optionnel Médecine Mol

Spécifiques des neurones Necroptosis: . C. elegans H.sapiens 1992-1994: Horvitz et al, ced3, ced4 et ced9 genes du nématode machinerie bien conservée phylogénétiquement . . favorise la dégradation protéique et

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