Guide Pratique De Microbiologie Alimentaire

La base de données REQUASUD estCette base de données permet éga-un outil d’aide aux producteurs wallonset aux laboratoires qui les conseillent.Elle apporte une meilleure connaissanceet à l’utilité d’analyser ses produits.la conception de plans d’analyses d’au-des contrôles microbiologiques, afin d’avoirCet autocontrôle inclut la mise en placeproduction mis en place (choix deslement de sensibiliser les producteurs àtocontrôle (choix des analyses à réaliserpleine confiance en la qualité de leurs pro-de bonnes pratiques d’hygiène et d’unmatières premières, manipulations oul’importance d’un système HACCP adaptéet fréquence, échantillonnages) ;duits finis. Ceci peut se faire dans le cadresystème HACCP (Hazard Analysis and Cri-techniques de conservation) ;d’un plan d’autocontrôle.tical Control Points), système intégré quides dangers associés à chaque type deproduction, car elle permet d’identifierles contaminants les plus fréquents dans2.3 Services proposéschaque type de produit et de mettre enLes laboratoires de la chaine Microbiolo-évidence les produits ou les étapes degie de REQUASUD disposent d’une exper-fabrication les plus sensibles.tise dans l’analyse de denrées alimentaireset peuvent conseiller le producteur dans : l’interprétation des résultats d’analyses ; l’amélioration de la qualité des processus de production ; la résolution de problèmes (par exemplecontaminants récurrents ou altérationde produits).consiste à identifier et à contrôler toutes3.1 Autocontrôleobligatoiresalubrité des denrées commercialisées.de production.Depuis l’Arrêté Royal du 14/11/2003,tout producteur est responsable de s’assurerque les denrées qu’il produit respectent lescritères légaux et ne présentent pas de dan-Une fois le système HACCP mis enplace, son efficacité doit être évaluée,par exemple grâce à des analyses sur leproduit fini.appelle cela « l’autocontrôle obligatoire ». de garantir aux consommateurs (et auxorganismes de contrôle) la sécurité et lales étapes « à risque » dans le processusger pour la sécurité des consommateurs. On3. Pourquoi faire analyser ses produits ? En Belgique, l’AFSCA (www.afsca.be)est l’autorité chargée d’assurer la sécuritéalimentaire. Elle veille au bon respect de lalégislation par les producteurs et distributeurs, et réalise des contrôles. La législationCes analyses permettent :définit également des critères microbiolo-de valider l’efficacité du système degiques à respecter dans les denrées.ExempleQuelques points critiques de la production de hamburgersLe producteur qui met unaliment sur le marchédoit s’assurer que l’alimentne contient pas de germessusceptibles de rendre leconsommateur malade. EnBelgique, le producteur estresponsable de la qualitédu produit qu’il met surle marché, et cela même sice producteur fait appel auxservices de sous-traitants.De nombreux cas de « toxiinfections alimentaires » sontnotifiés chaque année ; cesincidents, en plus du risquequ’ils représentent pour lasanté publique, font souventmauvaise publicité pourl’entreprise.A côté de l’aspect « sécurité desaliments », les analyses microbiologiques peuvent apporter auproducteur de denrées une information précieuse sur la stabilitéet la qualité technologique de sonproduit et le respect des bonnespratiques d’hygiène tout au longde la production.capable de pousser à 4 C, produit desarômes rances et putrides et des pigmentsverts en surface de l’aliment. Il arrive aussifréquemment que des denrées alimentairessoient acidifiées, gonflées et dégradéespar des bactéries lactiques, des levures oudes moisissures. Les micro-organismesd’altération ne rendent pas automa-En effet, la présence d’un taux impor-tiquement le produit dangereux outant de micro-organismes d’altération peutimpropre à la consommation, mais, enmodifier rapidement les propriétés organo-le dégradant, ils le rendent bien sou-leptiques d’un produit (goût, couleur, odeurvent invendable avant même la fin deou texture), et ce même si la chaine du froidla DLC (Date Limite de Consommation).est scrupuleusement respectée.6bactérie Pseudomonas spp ; cette bactérie,Les producteurs de denrées, même àIl n’est pas rare de voir des produits del’échelle artisanale, ont donc tout intérêtviande ou des produits laitiers altérés par laà suivre les règles d’hygiène et à effectuerEtapesMatières premièresDécoupeCuissonAssemblageDistribution à 60 CPointscritiquesPrésence einsuffisanteRe-contaminationRupture de lachaine du chaudContrôleQualité ou analysedes ingrédientsRefroidissement,désinfectionContrôle temps températureHygiène des mainset des surfacesConservationappropriée3.2 Les critèresmicrobiologiques3.2.1. De quoi s’agit-il ?ou unités formant des colonies) par grammemicrobiologiques « de sécurité » (critèresd’aliment.impératifs définissant l’acceptabilité d’unLes denrées alimentaires en courslot de denrée).Les critères microbiologiques défi-de production doivent satisfaire aux cri-Chaque critère définit plusieurs para-nissent les niveaux maximums de conta-tères microbiologiques « d’hygiène dumètres : la catégorie de produit, le micro-mination que l’on peut observer dans unprocédé » (critères indicatifs à différentesorganisme, la méthode analytique à utiliserproduit donné pour pouvoir le considérerétapes-clés de la production, indiquant la(méthode de référence), le stade d’applica-comme de qualité microbiologique accep-bonne maitrise du procédé de production).tion, le nombre d’échantillons à analyser partable. Ces limites sont le plus souventPour pouvoir être mis sur le marché, leslot de produit (n), l’éventuelle « tolérance »exprimées en CFU (Colony Forming Unitsaliments doivent satisfaire aux critères(c) et, enfin, les limites de contamination(m et M).Voici, par exemple, un critère issu du Règlement CE 2073/2005MatriceParamètrencmMStadeMéthodeFromage frais à basede lait pasteurisé ( )Staphylococcusaureus5210 CFU/g100 CFU/gFin defabricationISO 68887

Cela signifie qu’il faut analyser 5 échan-applicables aux denrées alimentaires ».les produits finis. Ces analyses doiventtillons par lot et que ces échantillons doiventIl faut toutefois garder à l’esprit que lesêtre décrites, par exemple en termes decontenir moins de 10 Staphylococcuscritères issus des règlements européensfréquence, de nombre d’échantillons àaureus par gramme (zone verte sur l’illus-priment sur les critères nationaux, ces der-analyser et de limites d’acceptation.tration), avec toutefois une tolérance de 2niers sont donc abrogés lorsqu’un critèreéchantillons pouvant se trouver entre 10 etcorrespondant est fixé au niveau européen.100 S. aureus par gramme (zone orange). Pour les producteurs de denrées alimen-de cinq échantillons par lot (« n » 5). EnSi 1 résultat est supérieur à 100 CFU/gtaires, trouver les critères microbiologiquesroutine, cela s’avère souvent coûteux et peu(zone rouge) le lot est rejeté (qualitéà respecter était donc une démarche assezjustifié, surtout si la taille des lots est limitée.microbiologique inacceptable).complexe. C’est pourquoi l’AFSCA a com-C’est pourquoi, lors des analyses de routine,pilé, en un document unique, l’ensemblede nombreux laboratoires proposent auxdes critères (indicatifs et impératifs, belgesentreprises de réaliser les analyses sur unet européens) à respecter en Belgique, ceseul échantillon par lot et, en cas de résultatSi 0, 1 ou 2 résultats se situent entresont les « Limites d'action pour les conta-douteux (compris entre « m » et « M »),10 et 100 et les autres résultats sontminants microbiologiques dans les denréesd’analyser plusieurs échantillons.inférieurs à 10, (cas de l’illustration) lealimentaires ». Le fichier Excel est disponiblelot est considéré de qualité microbiolo-sur le site internet de l’AFSCA et constituegique acceptable.une base complète de critères applicables.Si plus de 2 résultats se situent entre 10et 100 le lot est rejeté. Nous avons vu que la plupart des critères microbiologiques préconisent l’analyseCFU/g3.3 Pland’autocontrôleIl est, en effet, plus utile d’analyserun seul échantillon mais surd i ff é re n t s p a r a m è t re s ( p a rexemple les germes totaux,les entérobactéries, S. aureus,Clostridium perfringens et lessalmonelles) que d’analysercinq échantillons sur un seulparamètre.Pour des raisons économiques, le planning d’analyses peut également être allégé,sur les conseils du laboratoire, afin de seconcentrer sur les meilleurs indicateurs dela qualité pour l’entreprise.4. Comment se déroule une analyse ?3.3.1. De quoi s’agit-il ?m 10Un plan d’autocontrôle est l’ensemble M 100 1des mesures prises par l’entreprise pour 23 4pouvoir garantir la qualité et la conformitédes denrées qu’elle produit (par rapport aux exigences relatives tant à la sécurité(critères « légaux »), d’autres sont donnésà titre indicatif, pour permettre au producteur d’apprécier la qualité sanitaire ettechnologique de son produit (hygiène,conservabilité).décrit, par exemple, les mesures de tem-3.2.2. D’où viennent ces critères ?Certains critères microbiologiquessont harmonisés au niveau européen, afinde permettre le commerce de denrées ali-mières, la désinfection des équipements3.2.3. En brefou encore les analyses microbiologiquesQuels critères faut-il respecterréalisées sur le produit final. La mise enlorsque l’on est un producteur deplace d’un système d’autocontrôle estdenrées alimentaires ? Ce sont, du plusobligatoire pour les entreprises agroalimen-important au moins important :taires. Les producteurs qui font, en plus,1/ Critères Européensvalider leur système d’autocontrôle par un(CE 2073/2005 Amendements)}organisme reconnu, peuvent bénéficier2/ Critères additionnels« LimitesBelges (A.R., A.G.W.)d’action »de l’AFSCA3/ Critères indicatifsla sécurité de tous les consommateursde l’AFSCAde l’Union Européenne. Ces critères sont4/ Critères internes (guides d’autocontrôledécrits dans le Règlement CE 2073/2005 etsectoriels, critères basés sur l’analyse deils sont « impératifs ». Tous les producteursrisques ou des études scientifiques surde l’UE doivent les respecter pour pouvoirproduits similaires)3Analyses L'échantillonnage et le transport réfrigéré peuvent être réalisés par le laboratoire Quantité minimale d'échantillon à fournir : généralement 50 à 100 g Durée des analyses : généralement entre 1 et 5 jours, en fonction du paramètre Méthodes d'analyse utilisées : méthodes "de référence" ou méthodes "alternatives"de tenir compte des limitations des petitesentreprises, certains assouplissementspermettent à ce type d’entreprise de transposer de façon simplifiée les obligations enmatière d'autocontrôle et de traçabilité (les4Rapport Résultats des dénombrements ou recherches Eventuellement : interprétation des résultats ; comparaison aux critères en vigueurmodalités pratiques sont reprises sur le sitede l’AFSCA).3.3.2. Analyses microbiologiquesau sein d’un plan d’autocontrôleLe Règlement CE 2073/2005 est com-Le plan d’autocontrôle de l’entrepriseplété par la législation belge, comme pardécrit, entre autres, le planning des ana-exemple : « Arrêté Royal du 26/04/2009lyses microbiologiques à réaliser sur lesconcernant des critères microbiologiquesmatières premières, les surfaces ou encore82Envoi deséchantillonsd’avantages financiers ou « bonus ». Afinmentaires entre pays membres et d’assurercommercialiser leurs produits. Conseil : quelles analyses effectuer ? Exigences légales ? Détails pratiques : échantillonnage et transport ? Laboratoire accrédité ? Délais ? Offre de prixalimentaire qu’à la traçabilité). Ce planEchantillon5pératures, la traçabilité des matières preCertains critères sont obligatoires1Contact avecle laboratoire5Aide àl'interprétation Evaluation de la qualité microbiologique globale du produit En cas de résultat non-conforme, aide à l'identification des causeset à l’amélioration du procédé de production Orientation du client vers un organisme de support (ex : REQUASUD)9

Le processus analytique : les recherches4.1 Contact avecle laboratoirescrupuleusement ces consignes d’échan-protocoles validés AFNOR). Ces dernièrestillonnage afin de ne pas invalider le résultatsont des méthodes plus rapides et/ou moinsd’analyse.coûteuses, qui sont validées et reconnuesLe producteur qui souhaite faire analyser un produit prend contact avec unlaboratoire d’analyses. Pour des analysesd’autocontrôle, il est préférable de choisirun laboratoire accrédité (suivant la normeISO 17025).Lors de l’échantillonnage, le préleveurveillera à obtenir un échantillon représen-Les analyses se déroulent généralementtillon en le prélevant. Pour réaliser toutes lessuivant le même processus, en conditionsanalyses microbiologiques, un minimum destériles.50g de produit est généralement prélevé.le choix des analyses à réaliser. Il est inutile(et très coûteux) de réaliser une analysetillon se voit attribuer un code d’identifica-produit et des objectifs visés, le laboratoiretion. Il sera ensuite conservé au froid avantconseillera donc à l’entreprise l’analyse desd’être analysé le plus rapidement possible.lesquels des critères existent, cela afin depermettre une interprétation ultérieure desrésultats d’analyses.Chaque analyse apporte uneinformation particulière. Leslaboratoires du réseau REQUASUDsont aptes à conseiller le client surles paramètres à analyser dansson produit.4.2 Envoi deséchantillonsPour les dénombrements, l’échan- Ensemencement surmilieu spécifique etincubation Généralement24h à 48h Confirmation deséventuelles coloniescaractéristiques(tests biochimiqueset sérologiques).Rapport.En cas de présencede pathogènes :information au client.(10 X, 100 X, 1.000 X, etc.) et chaqueles paramètres microbiens. En fonction dumeilleurs indicateurs de qualité technolo-Enrichissement del'échantillon dilué Généralement24h à 37 C.tillon est dilué par dilutions décimalesA son arrivée au laboratoire, l’échan-également les paramètres analytiques pour 4.3 Analysescomplète d’un produit, c’est-à-dire de tousgique, d’hygiène ou de sécurité. Il favoriseraméthodes de référence.tatif du lot et à ne pas contaminer l’échan-Le laboratoire conseillera le client dans officiellement comme équivalentes auxdilution est mise en culture sur unmilieu gélosé spécifique, dans desboîtes de Petri. Ces boîtes sont ensuite4.4 Rapportincubées (à la température optimalede croissance du micro-organisme àPour le producteur, les analyses micro-dénombrer) de manière à permettreLe rapport d’analyse, envoyé dans lesà chaque bactérie présente de seplus brefs délais au client, contient les élé-coûteuses. Ces exigences se heurtent mal-multiplier jusqu’à former une coloniements suivants :heureusement aux réalités des laboratoiresvisible à l’œil nu. On dénombre ensuited’analyses, car la plupart des résultats les colonies présentes sur les boîtesd’analyse sont obtenus en 1 à 5 jours, cer-avec le numéro d’accréditation ducorrespondant à chaque dilution et ontaines analyses peuvent même prendre pluslaboratoire.considère que chaque colonie provientd’une semaine avant d’avoir les résultatsd’une seule bactérie au départ. Cettedéfinitifs. L’incubation (mise en culture deshypothèse n’est pas toujours exacte,boîtes de Petri pendant 20 à 120 heures àcar deux bactéries situées côte à côteune température précise, afin de permettrepeuvent ne former, en apparence,la croissance du micro-organisme recher-qu’une seule colonie. C’est pourquoi lesché) est souvent l’étape limitante car il fautmicrobiologistes expriment les concen-généralement cultiver les micro-organismestrations microbiennes en « CFU parpour pouvoir les dénombrer.gramme » (unités formant une colonie)biologiques devraient être rapides et peu Pour effectuer les analyses, les labo-peuvent être réalisés par le client ou par leratoires utilisent des méthodes validéeslaboratoire. Les consignes détaillées pouret reconnues officiellement. Il s’agit deétape d’enrichissement (permettant dele prélèvement de chaque type de produitméthodes « de référence » (telles quemultiplier le pathogène recherché et(lait, viandes ou eaux) sont décrites dansdécrites dans les normes ISO) ou bien dedonc d’abaisser son seuil de détection)des normes. Il est important de respecterméthodes « alternatives » (par exemple leset des tests de confirmation spécifiques. L’identification de l’échantillon et lesconditions de sa réception. et non en « bactéries par gramme ».L’échantillonnage et le transportLe nom du laboratoire, logo BELAC Pour les recherches, il faut ajouter une4.5 Aide àl’interprétationEn cas de besoin, les laboratoires duréseau REQUASUD peuvent aider leclient à interpréter les résultats d’analyseset à évaluer la qualité microbiologique deleur produit.En cas de dépassement des critères desécurité (par exemple présence de pathogènes), les denrées doivent être exclues deLes résultats de dénombrements, expri-la consommation humaine et retirées dumés en CFU par gramme d’aliment.marché et une notification doit être réaliséeLes résultats de recherches, exprimés enauprès de l’AFSCA.termes de « présence » ou « absence »En cas de dépassement des critèresdu pathogène dans une quantité don-d’hygiène du procédé, le producteur doitnée d’échantillon (souvent 25 g).prévoir des modifications adéquates de sesEventuellement, le laboratoire peutjoindre une interprétation des résultatsd’analyses, par exemple en les comparantaux critères microbiologiques existants.pratiques d’hygiène ou de son procédé defabrication.Ces résultats non-conformes doiventinciter le producteur à revoir les étapescritiques de son processus de fabricationpour identifier l’origine de la contaminationLe processus analytique : les dénombrementsdu produit ou l’étape entrainant la multiplication des contaminants. Le producteur Echantillonnage ettransport jusqu'aulaboratoire.10 Dilution del'échantillon 25g 225 ml dediluant Homogénéisation. Dilutions décimales etensencement Milieu géloséspécifique aumicro-organisme àdénombrer. Incubation A la températureoptimale du microorganisme analysé 20h à 120h,en fonction duparamètre.n’est pas seul dans cette démarche, le Comptagedes coloniescaractéristiques.Eventuellement :confirmation par destests biochimiques.laboratoire peut lui apporter des pistesd'amélioration ou le réorienter vers unorganisme spécialisé.Calcul du niveau decontamination etrapport.Les laboratoires du réseauREQUASUD ont pour missiond’apporter conseil et supportt e c h n i q u e a u x P M E a g ro alimentaires, par exemple pourl’identification de la sourced’une contamination ou pourl’amélioration de leur systèmeHACCP.11

5. Types d’analyses microbiologiquesIl existe de nombreux types d’analyses de microbiologiealimentaire dites « classiques », comme les dénombrements demicro-organismes d’altération ou indicateurs d’hygiène, ou encoreles recherches de pathogènes.l’identification d’un contaminant inconnu,du réseau REQUASUD. Afin de trouver lelaboratoire le plus approprié pour répondreIl ressort de la base de donnéesLe tableau suivant décrit les principalesà sa demande d’analyses, le producteurREQUASUD que les analyses les plusanalyses réalisées en routine par les laboratoires de microbiologie alimentaire.peut s’adresser à la cellule de coordina-souvent demandées aux laboratoires sontPar ailleurs, des analyses dites « sur-tion de REQUASUD, qui l’orientera enle dénombrement de la flore totale, desmesure » apportent des informationsfonction, entre autres, de la localisationentérobactéries, d’E. coli, de S. aureus et laspécifiques. C’est le cas, par exemple, desgéographique et du scope d’accréditationrecherche des pathogènes Salmonella spp.tests de détermination de la DLC, ou dedes laboratoires.et Listeria monocytogenes.NomDescriptionOrigineIntérêt de l’analyseExemples de limitesmaximales autorisées (M) (1)Illustrations : cas des denrées en Région wallonne (1994-2011) (2)Germes totaux aérobiesmésophilesouFlore totale aérobieEnsemble desmicro-organismes sedéveloppant à 30 Cen présence d’air,sur un milieu nutritif.L’environnement,les matières premières,les manipulations.La charge bactérienneprésente dans le produitest un indicateur del’hygiène globale duprocess et de l’efficacitédes techniques deconservation.Crème glacée :500.000 CFU/g.Germes totaux dans960 échantillonsd'américain.Ce comptage inclutles bactéries, les levureset les moisissures.Bactéries lactiquesmésophilesBactéries Gram qui produisent del’acide lactique parfermentation.Les bactéries lactiquessont non-pathogènes,mais peuvent provoquerl’altération des denrées(fermentation etacidification).La teneur en germestotaux est

a pour mission l'amélioration et la garantie de la qualité des produits agro-alimentaires wallons (Fig. 1). Depuis 1989, lA' SBL REQUASUD a développé et gère une infrastructure de mesure de la qualité des produits agricoles et agro-alimentaires d'une part, et de la qualité du milieu d'autre part, dotant ainsi le Service