Microbiología Aplicada : Manual De Laboratorio
MICROBIOLOGÍAAPLICADAMANUAL DE LABORATO RIOMaría Teresa Castañeda BrionesUNIVERSIOAOAUTONOlU ,IrIlETROPOllTANAlA.en. otI efl1 ol1le",PG .tzrapnlr.Ilrn
MICROBIOLOGÍAAPLICADAMA N UAL DE LABOR ATORIOMaría Teresa Castañeda BrionesU . " [ .SI(, .lI e. a' U I Oto . ."' H IlO I'OI I U 'hf;l,. I I 1fIDIvIsión de C ienCIllS Básica s e IngenIeríaOe pa rta menlo de Ciel"lCias Basteas
CONTENIDOvPrefacioReglamento de laboratorio de microbiología.VllEquipo indispensable en el laboratorio de microbiologíaIXMaterial indispensable en el laboratorioXlPráctica Núm. TituloPág.1.El microscopio12.Distribución de los microorganismos en la naturaleza143.Preparaciones de extensiones o frotis y tinción simple224.Tinción diferencial de Gram275.Tinclón de endosporas por la técnica de Schaeffer y31Fulton6.Tinción de flagelos bacterianos por el método de Leifson357.Esterilización por calor seco y calor húmedo428.Desinfección de agujas hipodérmicas por ebullición469. --Medios de cultivo . 49 -10.Antisepsia de la piel5711.Resiembra de tubo a tubo6012.Aislamiento de microorganismos a partir de un cultivo64mixto y obtención de un cultivo axénico13.Metabolismo bacteriano7314.Aislamiento de bacterias anaerobias formadoras de84esporas a partir de suelo de jardín15.Aislamiento e identificación de mohos del aire9016.Recuento de bacterias mesófilas aerobias en agua deconsumo humano104
17.Coliformes totales y fecales en agua de consumo110humano18.Investigación de coliformes totales y fecales en aguaresidual127.19.Determinación de estreptococos fecales en agua13720.Determinación de clostridios sulfito reductores en agua14421.Recuento de indicadores de contaminación fecal en150agua mediante filtración por membrana22.Investigación de coliformes totales y fecales en163desechos sólidos Y composta23.Determinación de bacterias sulfatorreductoras en agua17024.Investigación de protozoos y helmintos patógenos en173aguaPág.APENDICE A : Composición y preparación de medios de cultivo181APENDICE B : Preparación de colorantes205.APENDICE C: Preparación de soluciones y reactivos211BIBLlOGRAFIA219
MICROBIOLOGíA APLICADAManual de LaboratorioPREFACIOLa Microbiología es una ciencia que se encarga del estudio de losmicroorganismos, y ha logrado grandes avances como resultado de años deinvestigación, la cual está basada fundamentalmente en la observación y laexperimentación.Por lo anterior, considero que, para tener un mejor conocimiento y comprensión dela Microbiología, es absolutamente necesario contar con el apoyo del Laboratorio.La Microbiología tiene gran aplicación en diversas áreas tales como las siguientes:Médica, Agrícola, Industrial, Biotecnológica y Ambiental.En esta última, cada vez está adquiriendo más importancia debido a laparticipación de los diferentes grupos de microorganismos en la problemáticaambiental, no únicamente como contaminantes del ambiente e indicadores decontaminación, sino también por su gran influencia en la solución de diversosproblemas de contaminación, ya que juegan un papel muy importante en procesosde Biorremediación por ejemplo en la blorrecupsraclón de suelos contaminadoscon hidrocarburos, metales, insecticidas o algún otro agente tóxico.Para la elaboración de este Manual se seleccionaron técnicas de diferentes textosy Manuales de Microbiología, las cuales se organizaron y adecuaron al programade la unidad de enseñanza aprendizaje (uea ) de Microbiología Aplicada queforma parte del Plan de Estudios de la Licenciatura de Ingeniería Ambiental de laUAM-A, por lo que este Manual está dirigido a los alumnos de la uea deLaboratorio de Microbiología Aplicada de dicha licenciatura. En él se incluyenprácticas de Microbiología Básica y de Microbiología Aplicada, haciendo énfasisen el análisis microbiológico del agua.Con el desarrollo de las prácticas que integran este Manual el alumno sefamiliarizará con el uso del microscopio, preparación de extensiones y su tinción,preparación, esterilización y distribución de medios de cultivo, algunos métodos decontrol de los microorganismos, diferentes técnicas de aislamiento demicroorganismos aerobios y anaerobios y su identificación, así como también conla determinación de diversos indicadores de contaminación fecal del agua y otrastécnicas de laboratorio que permitirán conocer el grado de contaminaciónmicrobiológica en aire, agua y residuos sólidos.De manera general se puede trabajar simultáneamente en 2 prácticas por sesiónde laboratorio, por lo tanto, el tiempo dedicado al curso es el adecuado.Para lograr lo anterior, tengo una recomendación muy importante para losalumnos: "Leer las prácticas que se van a realizar en cada sesión, antes dellegar al Laboratorio",. de tal forma que se pueda aprovechar más eficientemente.v
MICROBIOLOGIA APLICADAManual de Laboratorioel tiempo. Igualmente les recomiendo que revisen las figuras y tablas, así comotambién los apéndices correspondientes lo cual les será de gran utilidad en eldesarrollo de las prácticas.Por otra parte quiero manifestar mi agradecimiento al \'0, Jorge Ruíz Sánchez,. quien me señaló algunos errores, los cuales se pudieron corregir oportunamente.Asimismo agradezco a mis hijos Ismael y Marisol y a la D.G. Blanca HortensiaRodríguez Rodríguez por su valioso apoyo en la preparación del manuscritooriginal de este Manual.MARIA TERESA CASTAÑEDA BRIONES."",'VI
MICROBIOLOGíA APLICADAManual de LaboratorioREGLAMENTO DEL LABORATORIO Y ALGUNAS MEDIDAS DE SEGURIDADDENTRO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGíA1. No se permitirá la entrada al laboratorio a los alumnos que lleguen 15 minutosdespués de la hora señalada.2. Queda prohibida la entrada a personas ajenas al laboratorio.3. Ningún alumno debe salir del laboratorio durante el tiempo que dure la práctica,sin previa autorización del profesor.4. Por ningún motivo se permitirá a los alumnos trabajar en el laboratorio mientrasno tengan puesta su bata blanca y limpia, así como también sus lentes deseguridad, cubreboca, cofia y guantes de cirujano estériles.5. Al alumno que no venga provisto del material necesario que le corresponde, deacuerdo con la práctica a realizar durante las sesiones de laboratorio, no se lepermitirá permanecer en el laboratorio.6. No colocar objetos personales que no vayan a ocupar durante la sesión delaboratorio sobre la mesa de trabajo. Usar los cajones de sus gavetas.7. No tirar basura o material no contaminado como algodón, papeles, cerillos u otro alsuelo, ni guardarla en los cajones de las gavetas, ni en los vertederos; éstosdeberán ser depositados en los botes destinados para ello.8. Es muy importante lavarse las manos con agua y jabón antes de empezar atrabajar y al abandonar el laboratorio.9. Antes de empezar y al terminar de trabajar, deberá limpiarse la mesa delaboratorio, primero con una franela húmeda para eliminar el polvo y enseguidacon algodón humedecido en solución desinfectante.10.Queda estrictamente prohibido comer, beber, fumar y en general llevarseobjetos a la boca tales como el lápiz, bolígrafo o algún otro, dentro dellaboratorio.11.Queda estrictamente prohibido pipetear con la boca las muestras para análisis,soluciones reactivos.óVII
MICROBIOLOGIA APLICADAManual de Laboratorio12. Aun cuando en el laboratorio no se manejan microorganismos patógenos,pudiera en un momento dado estar presente alguno o algunos de ellos encualquiera de las muestras a analizar, por lo cual es recomendable que losalumnos cuenten con las vacunas necesarias para evitar algún tipo deinfección. De esto se hará cargo el propio alumno.13. No se permitirá al alumno hablar dentro del laboratorio durante el desarrollo delas prácticas sin tener puesto el cubreboca, para evitar todo tipo decontaminación cruzada sobre todo en los cultivos puros.14. No colocar tubos acostados sobre la mesa de trabajo, utilizar siempre una gradillapara ello.15. En caso de romper o derramar material contaminado, verter sobre éste, soluciónde fenol al 5% y dejarla actuar por 15 minutos antes de limpiar. Notificar alprofesor o al ayudante cuando esto suceda.16. Mantener siempre separado el material sucio para esterilizar, material sucio paralavar y el material limpio, con su respectivo rótulo.17. No lavar el material contaminado sin antes haberlo esterilizado.18. Antes de esterilizar, ya sea en autoclave o en horno de calor seco, se deberá. quitar al material todo tipo de etiquetas.19. Al esterilizar en autoclave tubos, matraces o frascos con tapón de rosca, aflojaréstos ligeramente para lograr una mejor penetración del calor.20. No conservar en incubación o en refrigeración frascos, tubos, cajas de Petri oalgún otro material, sin rotularlos debidamente con el contenido, nombre delalumno o número de equipo y fecha, de lo contrario será desechado21. No almacenar material innecesario en el refrigerador.22. Al finalizar la sesión, cada alumno es responsable de la limpieza adecuada de suárea de trabajo, así como de la tarja que usa.23. Si un alumno rompe o extravía material, está obligado a reponerlo nuevo,. debiendo mostrar la nota de compra correspondiente.VIII
MICROBIOLOGÍA APLICADA·Manual de Laboratorio24. Los alumnos deberán leer previamente la o las prácticas que se realizarándurante cada sesión, debiendo presentar un diagrama de flujo de las mismas alllegar al laboratorio.25. Los reportes de las prácticas concluidas deberán entregarse el día señalado paraello, dentro del horario de laboratorio, escritos a máquina o en computadora y enun fólder limpio. No escribir nada con lápiz.26. Cada día de retraso en la entrega de los reportes, implicará un punto menos en lacalificación.NOTA:El incumplimiento de este Reglamento repercutirá en la calificación delaboratorio.EQUIPO INDISPENSABLE EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGíA-MicroscopiosAutoclavesHorno esterilizador de calor secoEstufa para secado de materialHorno de vacíoIncubadorasBaño incubador a 44 "C ( OSC) para coliformes fecalesBaño de agua, con control de temperaturaRefrigeradoresBalanza granatariaBalanza analíticaMedidor de pHCampana de extracción de gasesCampana de flujo laminarIncinerador para esterilizar asa bacteriológicaCentrífuga de alta velocidadCentrífuga de baja velocidadEquipos de filtración MilliporeFiltros SeitzEspectrofotómetroBombas de vacío
MICROBIOLOGIA APLICADAManual de LaboratorIo-Cuentacolonias QuebecJarras de anaerobiosisParrillas de calentamiento con agitación magnéticaAgitadores VortexAgitador orbital para matraces, botellas y tubosFermentadores sPicnómetrosLámpara de luz ultravioletaRotavaporLicuadoras de 2 velocidadesMuestreadores para aguaHidrómetrox
MICROBIOLOGíA APLICADAManual de LaboratorioMATERIAL INDISPENSABLE EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGíAAPLICADA-Bata blanca y limpiaAsa bacteriológicaPortaobjetos con y sin excavaciónCubreobjetosPinzas de disecciónPinzas para crisolPinzas con punta plana, para membrana milliporePinzas de MohrTijeras con punta romaMechero BunsenMechero FisherManguera de látexLámparas de alcoholTripiésTelas de asbestoBaños MaríaGradillas para tubos de diferentes dimensionesCanastillas de polipropileno y de aluminioCajas Petri de vidrio, de diferentes dimensionesCajas Petri estériles, desechablesPorta cajas Petri de acero inoxidableTubos de ensayo de diferentes dimensionesCampanas DurhamTubos para centrífugaMatraces Erlenmeyer de diversos volúmenesMatraces Kitasato de 1 y 2 LMatraces volumétricos de diferentes volúmenesVasos de precipitado de diferentes volúmenesVasos para licuadora resistentes al autoclaveVidrios de relojProbetas de diferentes volúmenesBuretas de diferentes volúmenesSoportes para buretaPinzas para buretaPipetas graduadas de 10, 5, 2 Y 1 mLPipetas volumétricas de diferentes volúmenesPipetas PasteurXl
MlCROBlOLOGIA APLICADAManual de Laboratorio-Micropipetas de diferentes volúmenesPipeteros de aluminio o de acero inoxidablePropipetas de tres víasSoporte para realizar lincionesEmbudos de separaciónEmbudos de filtración rápidaPapel filtroMembranas de filtración millipore (Tamaño de poro 0.45 urn)Membranas de asbesto para filtro Seltz de diferente tamaño de poroAgitadores de vidrioEspátulas de diferentes tamañosBisturíTapones de hulePisetasBotellas de RouxBotellas WinklerFrascos para reactivos de diferentes volúmenes, con tapón esmeriladoFrascos goteroFrascos de boca ancha resistentes al autoclave, para toma de muestrasFrascos de vidrio o de polipropileno resistentes al autoclave de 1 L Y 300 mLCápsulas de porcelanaCrisoles GoochDesecadorMorterosCerillos o encendedorAlgodónGasa (no estéril) .Rollo de Masking tapeLápiz grasoMarcador indelebleCaja de coloresTapa de un frasco o un compás para dibujar círculos.DetergenteJabón y jaboneraEscobillones para lavar tubos de 30 x 200, 18 x 150 y 13 x 100 mmFibra Scotch Brite (verde) con esponja, para lavar cajas PetriCaja de aplicado resFranela de cualquier color (60 x 50 cm aprox.)Rollo de papel sanitarioPapel aluminioXII
MICROBIOLOGíA APLICADAManual de Laboratorio-Papel parafilmPapel de estraza para envolver materialToallas de papeljeringasCubre bocasGuantes de cirujano estérilesCofiasLentes de seguridadLibreta de pasta gruesa de 100 hojas forma francesa (Bitácora)NOTA:Del listado anterior, los alumnos deberán de proveerse de algún material en formaindividual, otro por equipo y el resto será proporcionado en el laboratorio:Individual:-Bata blanca y limpiaAsa bacteriológicaCerillos o encendedorCubrebocasGuantes de cirujano estérilesCofiasLentes de seguridad1 Caja de colores1 Tapa de un frasco o un compás para dibujar círculosLibreta de pasta gruesa de 100 hojas forma francesa (Bitácora)Por equipo:-1 Caja de cubreobjetos1 Pinzas de disección1 Pinzas con punta plana, para membrana millipore1 Tijeras con punta roma1 Propipeta de tres vías3 Frascos gotero de 60 mL3 Frascos de boca ancha resistentes al autoclave, para toma de muestras500 g de Algodón1 Paquete de Gasa (no estéril)XIII
MICROBlOLOGIA APLICADAManual de Laboratorio-2 Rollos de Masking tape1 Lápiz graso1 Marcador indeleble1 Kg de detergente1 Jabón y jaboneraEscobillones para lavar tubos de 30 x 200, 18 x 150 y 13 x 100 mm, 1 de cadauno.1 Fibra Scotch Brite (verde) con esponja, para lavar cajas Petri1 Franela de cualquier color (60 x 50 cm aprox.)1 Rollo de papel sanitario1 Kg de papel de estraza para envolver material3 Paquetes o rollos de toallas de papel para secarse las manos.3 Jeringas desechables (de 10, 5 y3 mL)XIV
MICROBIOLOGíA APLICADAManual de LaboratorioPRÁCTICA Núm. 1EL MICROSCOPIOl. OBJETIVOConocer sus partes y su función, así como el cuidado, manejo y utilidad en elLaboratorio de microbiología.11. INTRODUCCiÓNEl microscopio es indispensable en el Laboratorio de Microbiologfa para el estudiode la morfologfa y estructura de los microorganismos, asf como su reacción adiferentes colorantes, lo cual junto con otros criterios, permitirá su identificación,por lo tanto, es importante conocer su adecuado manejo.Anthony van Leeuwenhoek, en 1676, gran apasionado en pulir lentes que utilizabapara examinar gran variedad de materiales, fue el primero en observar bacterias yprotozoarios en agua de lluvia, en infusiones diversas y en su sarro dental.La máxima amplificación que logró Leeuwenhoek en los diversos microscopiosque construyó fue de 300 diámetros.La perfección del moderno microscopio compuesto facilita el estudio de lamorfología de microorganismos y de algunas de las grandes estructuras de lacélula bacteriana.A finales del siglo XIX surgieron avances importantes en microscopía, período degran progreso en Microbiologfa.TIPOS DE MICROSCOPIOSimpleLos primeros microscopios, construidos por Leeuwenhoek alrededor de 1675, eransimples, es decir, contenían sólo una lente o lupa.CompuestoTiene varias lentes combinadas, capaces de producir gran aumento (Figura 1.1).
MICROBIOLOGIA APLICADAManual de Laboratorio. MICROSCopíA ÓPTICASe usa para aumentar el tamaño de la imagen aparente de los objetos, lo cualpermite observar los detalles estructurales de los microorganismos. Con lamicroscopía óptica se pueden lograr aumentos de 100 a 1,000 diámetros y, enalgunos casos, hasta 2,000, según el tipo de luz que se utilice y la forma deiluminar el objeto en estudio o preparación.Los microscopios ópticos pueden ser de varios tipos, siendo el microscopio ópticode campo claro, el más utilizado en microbiología. En la microscopía de campoclaro, el campo microscópico está brillantemente iluminado y los objetos enestudio aparecen más oscuros en el fondo.El microscopio óptico normal que se usa para observar bacterias y otrosorganismos celulares es un microscopio compuesto, el cual está provisto de unafuente luminosa, una lente condensadora de luz que la dirige hacia el objeto aobservar y dos juegos de lentes que ayudan a la amplificación de la imagen.A través de la refracción o reflexión de los rayos luminosos mediante el sistema delentes del microscopio, se forma la imagen del objeto, que es más grande que elobjeto mismo, permitiendo el examen de sus estructuras en detalle.Existen varios aditamentos que utilizados en el microscopio óptico ordinario,aumentan mucho su rendimiento como instrumento de observación, por ejemplomicroscopio en campo oscuro (ultramicroscopio), microscopio de contraste defases, microscopio de fluorescencia, microscopio de luz ultravioleta, microscopiode interferencia, microscopio de contraste de interferencia diferencial de nomarski.AMPLIFICACiÓNLa capacidad amplificadora de un microscopio compuesto es el producto delaumento individual de los oculares y los lentes objetivos. Un microscopio típicoque se usa en bacteriología tiene objetivos con poder de resolución de 10X, 40X Y100X y ocular de 10X, por lo cual es capaz de amplificar la imagen de la muestra100, 400 Y 1000 veces.En un aumento de 1000X, las bacterias y microorganismos grandes se puedenvisualizar muy bien, pero los virus y muchos de los detalles finos de las estructurasbacterianas no se pueden ver.2
MICROBIOLOGíA APLICADAManual de LaboratorioPODER DE RESOLUCiÓNLa resolución se define como el espacio de máxima aproxirnaclón entre dospuntos en el que aún se pueden observar claramente como dos entidadesindependientes, es decir, es la distancia entre dos entidades estructurales de unobjeto en la cual todavía se pueden observar como estructuras separadas en laimagen amplificada.El poder de resolución de un microscopio está sujeto a la longitud de onda de laluz y a la propiedad de las lentes conocidas como la apertura numérica (AN). Ellímite del poder de resolución de un microscopio es aproximadamente igual a0.61/AN, que para un microscopio óptico es de alrededor de 200 nm (nanómetros).A menor longitud de onda de la luz y AN de las lentes, será mejor el poder deresolución del microscopio. Por lo tanto, queda claro que el poder de resolución delos microscopios ópticos se encuentra restringido por AN que se obtenga de lossistemas de lentes y las longitudes de onda del espectro de luz visible.APERTURA NUMÉRICAEsta expresión, que suele abreviarse AN, indica la cantidad de luz que entra en unobjetivo desde un punto del campo del microscopio. Tal valor es de sumaimportancia, ya que, como se dijo anteriormente, de él depende el poder deresolución, la propiedad más importante de un objetivo.La AN de una lente depende del índice de refracción (N) del medio que llena elespacio entre el objeto y la parte frontal del objetivo, ydel ángulo (¡.¡) de los rayosde luz más oblicuos que puedan entrar al objetivo. La fórmula para calcular la ANes:AN N x sen /1/2El aire tiene un índice de refracción de 1.0, que limita la resolución que se puedeobtener, pero se puede incrementar la AN poniendo aceite de inmersión entre elespécimen y el objetivo, aumentando así el poder de resolución del microscopio.El aceite de inmersión tiene un índice de refracclon de 1.5, lo que aumentaconsiderablemente la AN y esto mejora el poder de resolución del microscopio.3
MICROBIOLOGlA APLICADAManual de LaboratorioMICROScopíA ELECTRÓNICACon el uso del microscopio ele
MICROBIOLOGIA APLICADA Manual de Laboratorio 12.Aun cuando en el laboratorio no se manejan microorganismos patógenos, pudiera en un momento dado estar presente alguno o algunos de ellos en cualquiera de las muestras a analizar, por lo cual es recomendable que los alumnos cuenten con la
1 Teoría de la Gestalt Aplicada a la música Traducción del trabajo realizado por Kevin McDonald consultado el 14 de abril de 2013 en . Niveles de UTG Una nueva UTG a nivel inmediatamente superior será iniciada para la percepción cuando ocurra una UTG cuya disyunción (en relación con la UTG previa a idéntico nivel .
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de la docencia y la investigación. Están adscritos administrativamente a la Facultad de Ciencias los Departamentos de Física Aplicada Física Fundamental Física General y de la Atmósfera Geología Informática y Automática Matemáticas Matemática Aplicada Cada uno de dichos Departamentos engloba a todos los profesores de las áreas de .
s ao utilizados. Um estudo comparativo utilizando dados reais e apresentado em [8]. A mesma transforma c ao da vari avel, quantidade de chamadas, utilizada em [17] e tamb em aplicada neste artigo. A previs ao por tipo de chamadas e outro aspecto tratado com alguns modelos mistos apresentados.
SILVICULTURA Y FISIOLOGIA VEGETAL APLICADA El proceso dinámico de la silvicultura empieza con el mejoramiento de semillas de las especies forestales leñosas, propagación de plantas, plantación, manejo del bosque y aprovechamiento industrial. Aunque en principio la silvicultura se centraba en la producción maderera como fuente disponible .
parâmetro denominado K, que é o fator de intensidade de tensão na ponta da trinca (energia), e é calculado por: 14 K F V S* a Onde F representa uma função que depende tanto do tamanho, quanto da geometria da trinca e do corpo de prova, bem como da maneira que é aplicada a carga. a é o tamanho da trinca; σé a tensão aplicada.
Instituto de Matem a tica Pura e Aplicada . na o-observa veis em quest ao. O processo de otimiza ca o utilizado visa maximizar a . similhanc a que posteriormente e maximizada atrav es de um processo de otimiza cao, chegando-se nos paraˆmetros o timos.
Artificial Intelligence (AI) has the potential to make a significant difference to health and care. A broad range of techniques can be used to create Artificially Intelligent Systems (AIS) to carry out or augment health and care tasks that have until now been completed by humans, or have not been possible previously; these techniques include inductive logic programming, robotic process .
