Utilisation Des Spermatozoïdes Testiculaires En ICSI. Inté .
[ AZOOSPERMIEAndrologie(2001), 11, n 2, 9-20U t i l i s a t i o n des s p e r m a t o z o i d e s t e s t i c u l a i r e s enICSI. Int r t de la c u l t u r e in vitro.R e v u e de la littratureB. SCHUBERT, G. GRIZARD, D. BOUCHERLaboratoire de Biologie du Ddveloppement et de la Reproduction - CECOS, HStel-Dieu, Clermont-FerrandRI SUM] m i l i e u x de c u l t u r e avec de la FSH recombin a n t e s'av re aussi efficace.Au c o u r s d e ces d e r n i r e s a r m i e s les tentatives d'ICSI r alis es a v e c des s p e r m a t o zoides t e s t i c u l a i r e s se sont c o n s i d r a b l e m e n ta c c r u e s . C e p e n d a n t , l'une des difficult s techn i q u e s t i e n t a u fait q u e la mobilit des sperm a t o z o i d e s est e x t r m e m e n t r d u i t e . U na c c r o i s s e m e n t de la m o b i l i t d a v a i t t observ apr s u n e i n c u b a t i o n des pr l vements testiculaires pendant quelques heures.Dans r o p t i q u e d ' a u g m e n t e r les c h a n c e s desucc s, u n e c u l t u r e in v i t r o des s p e r m a t o zoides, pr alable I'ICSI, a t envisag e.Nous r a p p o r t o n s ici la r e v u e de la l i t t r a t u r es u r ce sujet.La c u l t u r e in v i t r o p e u t tre associ e la cong lation des s p e r m a t o z o i d e s et la s q u e n c ec u l t u r e in v i t r o / c o n g d l a t i o n d o n n e r a i t dem e i l l e u r s r s u l t a t s q u e la s q u e n c e cong lat i o n / c u l t u r e in vitro.Les q u e l q u e s t r a v a u x s u r l'utilisation e n ICSIdes s p e r m a t o z o i d e s m a i n t e n u s en c u l t u r e inv i t r o p e n d a n t I 2 j o u r s r a p p o r t e n t des r sultats s a t i s f a i s a n t s e n t e r m e de t a u x de f cond a t i o n et de grossesse.La c u l t u r e in v i t r o de s p e r m a t o z o i d e s testiculaires p e u t c o n s t i t u e r u n e voie de r e c h e r c h ei n t r e s s a n t e p o u r a m l i o r e r les r s u l t a t s e nICSI, d a n s les cas o/1 la q u a n t i t de s p e r m a t o zoides r e t r o u v e et/ou l e u r mobilit sont tr sfaibles. De plus, elie n o u s p a r a i t tre u n b o nmodule d' tude des m c a n i s m e s d ' a c q u i s i t i o nde la mobilit des s p e r m a t o z o i d e s .Dans les a z o o s p e r m i e s o b s t r u c t i v e s , la cult u r e in v i t r o p r s e n t e p e u d'int r t puisque,except une ventuelle " m a t u r a t i o n " dess p e r m a t o z o i d e s p e n d a n t c e t t e p riode, u npourcentage appreciable de spermatozoidesm o b i l e s est s o u v e n t o b s e r v r a p i d e m e n tapr s le t r a i t e m e n t de la biopsie.Mots clds : spermatozo des testiculaires, culture invitro, azoospermie, congdlation, ddcongdlation.Dans les a z o o s p e r m i e s n o n o b s t r u c t i v e s lac u l t u r e in v i t r o p a r a i t j u s t i f i e , p u i s q u el o r s q u e l'on r e t r o u v e des s p e r m a t o z o i d e sd a n s la biopsie, ils sont g n r a l e m e n t immobiles. C e p e n d a n t , la p l u p a r t des a u t e u r s s'acc o r d e n t r e c o n n a l t r e q u e les r s u l t a t sr e s t e n t al atoires : a u t e r m e de la c u l t u r e , soitil existe u n gain de mobilitY, soit a u c o n t r a i r ela p l u p a r t des s p e r m a t o z o i d e s sont morts.Correspondance : B. Schubert, Laboratoire de Biologie duDdveloppement et de la Reproduction - CECOS, HStelDieu, Boulevard Ldon Malfreyt, 63000 Clermont-Ferrande-mail : bschubert@chu-clermontferrand.frPrix de DESS ddcernd par la Socidt d'Andrologie deLangue Franqaise. Prdsentation au XVIl me Congr s dela SALF, 7-8 ddcembre 2000, Bordeaux.Q u e l q u e soit le t y p e d ' a z o o s p e r m i e , lesm e i l l e u r s r sultats sont o b t e n u s apr s 3-4j o u r s d e c u l t u r e . La s u p p l e m e n t a t i o n d e s9
I. I N T R O D U C T I O Nlaires donnant alors de meilleurs r6sultats queles spermatozoides 6jacul6s et immobiles [16,22, 36], il est un point sur lequel les auteurss'accordent : l'utilisation de spermatozoidesmobiles donne toujours les meilleurs r6sultatsen ICSI [17, 22, 27, 24, 26, 35].L'av6nement de l'injection intracytoplasmiquede spermatozo des (ICSI) a permis deshommes r6put6s jusqu'alors st6riles de procr6er [31]. Plus r6cemment, en utilisant enICSI des spermatozo)'des testiculaires, desenfants sont n6s au sein de couples dontl'homme pr6sentait une azoospermie. Lepronostic de ces hommes en terme de fertilit6 adonc radicalement chang6. L'exploration desazoospermies permet classiquement de lesclasser en 2 grands groupes : les azoospermiesobstructives et les azoospermies non obstructives. Dans ces deux grandes classes d'azoospermie, m me si les 6tiologies sont tr6s diff6rentes, des naissances ont 6t6 rapport6es [7,37, 38]. Cependant, dans 25 30 % desazoospermies, la biopsie testiculaire ne retrouve pas de spermatozoides, sans qu'aucun facteur clinique ni biologique ne puisse le pr6dire[23]. Ce chiffre s'616ve jusqu' 40 % dans lesazoospermies non obstructives [32].Classiquement la mobilit6 des spermatozoYdesapparait au cours de la travers6e de l'6pididyme [22]. Dans les pr416vements testiculaires, des spermatozoides mobiles peuventcependant 6tre retrouv6s apr6s dilac6rationdes tissus et incubation quelques heures37 dans des milieux de cultures classiques.Ces observations ont 6t6 publi6es initialementpar Nagy et al. [25] : quelques minutes apr6s labiopsie testiculaire, t o u s l e s spermatozoides6taient immobiles puis apr6s une demi-heure2 heures d'incubation, plusieurs spermatozoides se sont r6v616s mobiles (non progressifs). Craft et al. [5] ont remarqu6 qu'en laissant les pr616vements testiculaires 37 pendant 24 72 heures, il existe une augmentation significative du nombre de spermatozoidesmobiles progressifs, et particuli6rement entre48 et 72 heures. D'ailleurs ces auteurs peinentcroire qu'une telle proportion de spermatozoides puissent "come to life". Ils n'apportentpas d'explication ces r6sultats mais envisagent la possibilit6 de facteurs bloquant lamobilit6 dans le testicule et qui auraient uneaction diminu6e apr6s leur dilution dans lesmilieux d'incubation. Les spermatozoides testiculaires, reconnus comme immobiles, pourraient alors acqu6rir une mobilit6 apr6s uneculture in vitro plus ou moins prolong6e.Toutes ces observations peuvent servir de basepour faire 6voluer les techniques d'ICSI.Aussi la cryoconservation de ces pr616vementss'est d6velopp6e. La r6alisation pr6alable de ]abiopsie testiculaire permet d'6viter une stimulation et une ponction ovarienne inutile siaucun spermatozoide n'6tait retrouv6.Les spermatozoides testiculaires frais donnenten g6n6ral des taux de f6condation plus faiblesque les spermatozoides 6jacul6s frais : 47,6 %v e r s u s 58,7 % [11]. Les manipulations pr6alables pourraient aussi intervenir puisque avecdes spermatozoides congel6s/d6congel6s, lesr6sultats en ICSI seraient plus faibles qu'avecdes spermatozoides testiculaires frais [6], cequi n'est cependant pas v6rifi6 par d'autresauteurs [12, 14] qui retrouvent des r6sultatscomparables dans les 2 situations. De m me,concernant la nature de l'azoospermie, lesr6sultats sont contradictoires [12, 33, 39].Nous rapportons ici les donn6es de la litt6rature concernant l'effet de la "culture in vitro"sur la qualit6 des spermatozo des testiculaireset les cons6quences 6ventuelles sur les r6sultats en ICSI.Toutes ces donn6es sont en r6alit6 difficilementcomparables entre elles. La nature de l'azoospermie n'est pas toujours pr6cis6e et lacomparaison des r6sultats obtenus avec desspermatozo des frais et des spermatozoidescongel6s/d6congel6s n'est pas toujours ais6e.Bien que l'utilisation de spermatozo des immobiles puisse permettre l'obtention de grossesses [22, 27, 34, 36], les spermatozoides testicu-Notons que le terme de "culture in vitro" utilis6 par les auteurs anglo-saxons est un abus delangage. I1 correspond en r6alit6 une technique in vitro de maintien en survie des spermatozo des.Nous n'aborderons pas les cas d'immobilit6majeure des spermatozo des 6jacul6s li6s des10
H. T E C H N I Q U E S ET ANALYSESGENERALEMENT UTILISEESpathologies flagellaires telles que l'absence deb r a s de dyn ine, le s y n d r o m e des flagellescourts, pour lesquelles bien videmmenta u c u n e acquisition de mobilit6 n'est a t t e n d r ed a n s ces a n o m a l i e s s t r u c t u r a l e s . I1 r e s t ec e p e n d a n t possible que, d a n s les cas que n o u sallons voquer, des a z o o s p e r m i e s soient assocites de telles pathologies, m a i s elles sontp r o b a b l e m e n t tr s rares.1. Crit res d ' a p p r c i a t i o n de la mobilitY.L' valuation de la mobilit fait le plus s o u v e n tr f6rence la classification de I'OMS [43], end i s t i n g u a n t 2 g r a n d s g r o u p e s : les s p e r m a t o zo des a y a n t u n e mobilit progressive (classification "a" et "b" de I'OMS) et ceux a y a n t u n emobilit r duite ("c"). Cette derni re cat goriefait l'objet de diff6rentes a p p e l l a t i o n s selon lesa u t e u r s : m o u v e m e n t s faibles, secousses, t r e m b l e m e n t s , p o u r i n s i s t e r s u r la r e c h e r c h e tr sm i n u t i e u s e d ' u n m o u v e m e n t . L'un d ' e n t r e euxest encore plus clair en e x p l i q u a n t que c h a q u es p e r m a t o z o i d e est observ p l u s i e u r s secondes,De m m e n o u s n ' a b o r d e r o n s p a s le cas desspermatozo des pididymaires. E n effet, d a n sles ponctions p i d i d y m a i r e s r6alis es d a n s lesa z o o s p e r m i e s obstructives, la mobilit est d j appreciable et la c u l t u r e in vitro n'entra nea u c u n e a m e l i o r a t i o n [8, 29].Tableau 1 : Composition des diff rents milieux et conditions de culture des s p e r m a t o z o f d e s testiculaires.Milieu de basesupplementprot iqueTemp.AtmosphereT6 tamponn l'HEPESHTF tamponn aubicarbonate10% s6rum humain37 air 5% CO210% s rum humain37 air 5% CO2Zhu et al, 1996; 1997 [44, 45]IVF937 air 5% CO2Liu et al, 1997 [19]B23% SSS37 air 5% CO2Urman et al, 1998 [40]EBSS p nicilline HSA pyruvate37 932 37 90% N2 5%CO2 5% 02Edirisinghe et al, 1996 [8]Van den Bergh et al, 1998 [41]EBSS tamponn au 20% s rum humainEmiliani et al, 1999; 2000 [9, 10] bicarbonateBalaban et al, 1999 [3]EBSS /- FSHrecombinante0,5% HSA30 ?Jaroudi et al, 1999 [15]IVF?ambianteambianteHu et al, 1999 [13]HTF10% SSS37 air 5% CO2Angelopoulos et al, 1999 [2]HTF6% Plasmanate37 air 5% CO2Liu et al, 1999; 2000 [20, 21]HTF tamponn I'HEPES3% SSS37 air 5% CO2Temp. : temperature d'incubation ; EBSS : Earle's Balanced Salt Solution (Sigma, Aldrich) ;FSH recombinante (Puregon, Organon) ; HTF : Human b a l Fluid (Irvine Scientific) ;HSA : Human Serum Albumin (Irvine Scientific) ; IVF medium (Medi-Cult, Denmark) ;Plasmanate (National Hospital Specialties, Hackensack, NJ, USA)SSS : Substitute Synthetic Serum (Irvine Scientific) ; T6 : ; milieu de type EBSS11
pour permettre, 6ventuellement, de mettre en6vidence de faibles mouvements qui n'auraientpas 6t6 observ6s dans un premier temps [2].Ces mol6cules permettent d'obtenir en 30 minutes d'incubation une mobilit6 comparablecelle obtenue apr6s 48 h de culture in vitrodans des milieux d6pourvus de ces substances.Toutefois les risques toxiques potentiels de cesmol6cules pour l'ovocyte ou l'embryon ne peuvent pas 6tre exclus, m me si apr6s la culture,un lavage est toujours r6alis6.2. Conditions exp6rimentales (Tableau 1).Les fragments testiculaires dilac6r6s sont eng6n6ral d6pos6s, apr6s centrifugation et 61imination des plus gros d6bris cellulaires, dans unmilieu de culture en goutte sous huilemin6rale, puis incub6s 37 sous atmosph6recontr616e 5 % de CO2 et 95 % d'air. Des temp6ratures d'incubation inf6rieures ont 6t6 utilis6es : temp6rature ambiante, 30 32 mais avec des avantages qui restent limit6s. A32 la mobilit6 se maintient plus longtempsqu' 37 mais la proportion maximale despermatozoides mobiles obtenue entre le 36 etle 46 jour de culture, est comparable pour lesdeux temp6ratures [41]. Le plus souvent, laculture in vitro n'exc6de pas 4 jours et aucunchangement de milieu n'est effectu6 pendantcette p6riode.En fait, les m6canismes mol6culaires mis enjeu dans l'acquisition de la mobilit6 des spermatozoides restent mal connus. I1 sembleraitcependant que les deux principaux secondsmessagers les plus probablement impliqu6sdans ce processus soient I'AMPc et le pH [1].III. RESULTATS1. Culture in vitro de spermatozoides test i c u l a i r e s frais o b t e n u sdansdesazoospermies non 6tiquet6es et dans desazoospermies obstructives (Tableau 2).La distinction entre les azoospermies obstructives et les azoospermies non obstructives n'estpas toujours 6tablie. Aussi, dans notre 6tudenous avons regroup6 les r6sultats se rapportant aux azoospermies non 6tiquet6es et auxazoospermies obstructives, et analys6 de fa ons6par6 les r6sultats relatifs aux azoospermiesnon obstructives.Les incubations sont g6n6ralement r6alis6esdans des milieux chimiquement d6finis (TypeEarle tamponn6 au bicarbonate ou l'Hepes).Ces milieux peuvent 6tre enrichis : ajout d'extraits biologiques, d'hormones. Un apportprot6ique est r6alis6 soit par du s6rum ou del'albumine (HSA) des concentrations variables de 0,5 % 20 %, soit par le Plasmanateou un suppl6ment appel6 , , SubstituteSynthetic Serum qui contient en r6alit6 84 %d'albumine humaine.Bien que l'expression des r6sultats diff'ereselon les 6quipes, l'ensemble des donn6es montre qu'il existe g6n6ralement une am61iorationde la mobilit6 au cours du temps. Au momentdu pr616vement testiculaire (J0), la mobilit6progressive est soit tr6s faible soit absente etelle augmente progressivement pour atteindreun maximum J3 ou J5 [8, 19, 45]. La mobilit6 totale, souvent appr6ciable au moment dela ponction testiculaire, suit approximativement la m me 6volution au cours de la culture[2, 9, 10, 13, 19, 28, 29]. Son maintien d6penddes conditions exp6rimentales, en particulierde la temp6rature, puisqu' 32 20 % despermatozoides mobiles sont encore pr6sentsapr6s 10 jours de culture [41], alors qu' 37 la plupart des spermatozoides sont d6j mortsapr6s 7-8 jours de culture [19].Aucun de ces milieux n'a fait la preuve de sasup6riorit6 par rapport aux autres. Seule laFSH recombinante la dose de 25 mUI/ml permet une augmentation significative du nombrede spermatozoYdes mobiles apr s 24 heures deculture [3]. Le m6canisme d'action de la FSHest probablement indirect, puisque les spermatozoides ne poss6dent pas de r6cepteurs cettehormone. La FSH pourrait agir via les cellulesde Sertoli, pr6sentes dans les milieux de culture qui exerceraient leur action par contactdirect ou par l'interm6diaire de leurs produitsde s6cr6tion selon que la pr6paration des tissustesticulaires provoque ou non une dispersiondes cel]ules de Sertoli et des spermatozoYdes.Au cours de la culture, il existerait aussi unemodification de la morphologie de certainsspermatozoides avec notamment une perte deDes suppl6mentations avec la pentoxifylline etla 2-d6oxyad6nosine ont aussi 6t6 r6alis6es [2].12
Tableau 2 : Culture in vitro de spermatozofdes testiculaires obtenus p a r t i r d' chantillonspr lev s clans des azoospermies obstructives ou non tiquet es.Proportion de patients avec des spermatozoides mobilesJ0J1Zhu et al, 1996" (n 3) [44]J2J3J5J6J9282J103/318/2019/20Urman et al, 1998 (n 10) [40] 10/1010/10Hu et al, 1999' (n 20) [ 1 3 ]18/20Zhu et al, 1997 (n 20) [45]J414/2019/20Pourcentage moyen de spermatozo des mobilesEdirisinghe et al, 1996 (n l)[8]01015253538Liu et al, 1997 (n 17) [19]2 6219 5033 3753 1948 3131 23Nijs et al, 1997" (n 35) [28]5191Nijs et al, 1998" (n 5) [29]51714222Van den Bergh et al, 1998"(n 7) [41]5320Angelopoulos et al, 1999(n 7) (a) [2]5911104Angelopoulos et al, 1999(n 3) [2]03421Emiliani et al, 1999(n 6) [9]21Emiliani et al, 2000(n 6) [10117542848473231333018J0 Jn :nombre de jours de cultureLes caract6res en gras indiquent la mobilit6 progressive* : azoospermies non 6tiquet6es(a) : seuls sont pris en compte les 6chantillons pr6sentant des spermatozoides mobiles lors de la ponctionrestes cytoplasmiques [44], conduisant u na c c r o i s s e m e n t des s p e r m a t o z o i d e s morphologiquement n o r m a u x (3 % v e r s u s 2 1 % )[19].age m o y e n de spermatozoides mobiles augm e n t e et dans certains cas on observe led6veloppement d'une mobilit6 progressive. Lem a x i m u m se situe apr s 2-4 jours de culture[2, 45]. La pr6sence de F S H r e c o m b i n a n t e dansle milieu de culture a u r a i t u n effet b6n6fiquesur le d4veloppement de la mobilit6 [3].2. C u l t u r e i n v i t r o d e s p e r m a t o z o i d e s t e s ticulairesfraisobtenusdansdesa z o o s p e r m i e s n o n o b s t r u e t i v e s (Tableau 3,Figure1).Si a u c u n spermatozoide mobile n'est observ4 lej o u r de la ponction testiculaire, pour certaines6quipes, la culture n'apporte a u c u n e am61ioration [2, 19]. I1 existe m me u n effet d616t6re del'incubation puisque des spermatozoa'des init i a l e m e n t immobiles mais vivants, ne mont r e n t plus a u c u n signe de vitalit6 apr6s 24 96h e u r e s de culture comme en a t t e s t e n t les col-Les 4chantillons p e u v e n t tre divis6s en deuxgroupes selon la pr6sence ou non de spermatozoides mobiles le j o u r de la ponction.L o r s q u ' u n e faible mobilit6 existe, toujours nonprogressive, celle-ci se m a i n t i e n t ou estam61ior6e au cours de la culture. Le pourcent-13
Tableau 3 : Culture in vitro de spermatozofdes testiculaires obtenus d partir d'dchantillonspr levds dans des azoospermies non obstructives.Proportion de patients avec des spermatozo'ides mobilesJOJ1J2J35/7Zhu et al, 1997 (n 7) [45]0/75/7U r m a n et al, 1998 (n 66) [40]66/6665/66J4J50Pourcentage moyen de spermatozo des mobilesLiu et al, 1997 (n 9) [19]00000Angelopoulos et al, 1999(n 3) (a) [2]28800Angelopoulos et al, 1999(n l) [2]0222000Angelopoulos et al, 1999(n l) [2]00000Balaban et al, 1999 (n 70) [3]0 33Balaban et al, 1999 (n 73) FSH [3]8 71JO a J n :nombre de jours de cultureLes caract res en gras indiquent la mobilit progressive(a) : seuls sont pris en compte les chantillons pr sentant des spermatozo des mobiles lors de la ponction2520t5oN1050123456dur e de la cuHure (jours)F i g u r e 1 : E v o l u t i o n de la mobilit p r o g r e s s i v e (%) des spermatozo des t e s t i c u l a i r e s a u cours de la c u l t u r ein vitro: E t u d e d a n s 11 cas d ' a z o o s p e r m i e non o b s t r u c t i v e [19]. On note u n e a u g m e n t a t i o n a p p r e c i a b l e dela mobilit p r o g r e s s i v e d a n s 6 cas s u r 11. On ne d i s t i n g u e que 8 courbes, les 3 a u t r e s s o n t c o n f o n d u e s avecr a x e des abscisses.14
orants vitaux [18, 19]. Par contre d'autresauteurs observent des spermatozoides mobilesapr6s 1 3 jours de culture [2, 44].cependant plus faible que celle observ6e apr6sculture des spermatozoides non congel6s(Tableau 2).En am61iorant leur mobilit6, la culture in vitrodes spermatozoides testiculaires permet der6aliser I'ICSI dans de meilleures conditions.En effet, le temps de recherche de spermatozoides mobiles dans ces pr616vements estdiminu6 (5 minutes v e r s u s 15 minutes par ovocyte) [13] et la proportion d'ovocytes inject6savec des spermatozo des mobiles est augment6e [3]. Dans les azoospermies non obstructives, la pr6sence ou non de spermatozoides lejour de la ponction testiculaire est difficilementpr6visible et l'effet de la culture in vitro enterme de mobilit6 s'av6re al6atoire. Dans cesconditions, il est conseill6 de r6aliser la ponction testiculaire le jour de la ponction ovocytaire ou 6ventuellement, d'effectuer une cong61ation des spermatozoides.Les spermatozoides testiculaires maintenus enculture pendant 3 jours pr6sentent unemeilleure r6sistance la cong61ation/d6cong61ation que les spermatozoides non cultiv6s :13
meilleurs r sultats que la s quence cong la- tion/culture in vitro. Les quelques travaux sur l'utilisation en ICSI des spermatozoides maintenus en culture in vitro pendant I 2 jours rapportent des r sul- tats satisfaisants en terme de taux de f con- dation et de grossesse.
dent en faveur de rintervention d'autres g nes en aval ou en amont de SRY. Ainsi, la plupart des hommes 46,XX ont h6rit6, par translocation, du g6ne SRY, responsable de la diff6renciation des gonades dans le sens testiculaire, mais dans 10% des cas le g ne SRY n'est pas retrouv6. De m6me, si l'analyse de
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PureSpe 'm permet de limiter la perte en spermatozoides sur des pr l vements qui sont souvent moins cellulaires que dans les cas d'azoospermie excrfitoire. L'addition de stimulant de la mobilit (telle que la Pentoxifylline) ou la culture in vitro pendant 3 jours dans le cas d'akin sie, permet d'amd-
Tulang-tulang pembentuk rangka tubuh . 12 3. Tulang-tulang di regio manus tampak . Anatomi hewan ini yang dipelajari adalah anatomi tubuh hewan piara. Pelaksanaan perkuliahan dan praktikum anatomi hewan dilakukan setiap minggu sesuai jadwal dengan beban 3 sks (1-2) pada mahasiswa semester 1. Pelaksanaan meliputi tutorial, pretest, praktikum di laboratorium, pembuatan laporan, dan ujian .
