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CULTIVO DETEJIDOS VEGETALESIsidro Elías Suárez Padrón, Ph. D.1
Cultivo de Tejidos Vegetales, Fondo Editorial Universidad de Córdoba,Cra. 6 No. 77 -305 Montería Colombia,ISBN 978-958-5104-09-9Edición 2020Isidro E. Suárez Padrón, Ph. D.,Profesor Biotecnología Vegetal, Facultad de Ciencias Agrícolas,Universidad de Córdoba.Email: iesuarez@correo.unicordoba.edu.coDiseño, Diagramación e impresión: GRÁFICAS DEL CARIBE S.A.S. Cra. 1B No. 40-42 MonteríaTel. (57) (4) 782 6622Esta obra está bajo una Licencia Creative Commons Atribución-NoComercial 4.0 Internacional.2
DEDICATORIAA Claudio y Juan.3
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AGRADECIMIENTOSEl autor expresa sus agradecimientos a:La Universidad de CórdobaLa Vicerrectoría de Investigación y ExtensiónLa Facultad de Ciencias AgrícolasEl Departamento de Ingeniería Agronómica y Desarrollo RuralRodolfo Sánchez TorrecillaEl Equipo de Trabajo del Laboratorio de Biotecnología Vegetal de laUniversidad de Córdoba5
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CONTENIDOPRESENTACIÓN111.1.11.21.31.4PREHISTORIA E HISTORIA DEL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALESEl primer cultivo de tejidosLa teoría celular y totipotenciaEl primer cultivo in vitroCrecimiento de tejidos in vitro1.6Micropropagación1.81.91.101.111.12Cultivo de meristemos y Agrobacterium tumefaciensCitocininas y organogénesisMedios de cultivoEmbriogénesis somáticaSe prueba la teoría celular131414141516171717181819192.2.12.22.3EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALESÁreas del laboratorioMedidas de seguridadEquipos, utensilios y reactivos básicos necesarios212226273.3.13.23.3TÉCNICA ESTÉRIL DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALESTipos de contaminantes en el cultivo in vitroFuentes de contaminaciónTécnica estéril293032344.4.14.2MEDIOS DE CULTIVOComponentes de un medioFormulación y preparación de medios de cultivo4142505.5.15.2MICROPROPAGACIÓN DE PLANTASGeneralidades de la micropropagaciónMétodos de micropropagación de plantas5758597
6.6.16.26.3SUSPENSIONES CELULARESMaterial vegetalFases de un cultivo en suspensión celularMedición del crecimiento en suspensiones celulares798080847.7.17.2CONSERVACIÓN DE GERMOPLASMA IN VITROAlmacenamiento por crecimiento lentoCrioconservación8789898.8.18.2CULTIVO DE PROTOPLASTOSAislamiento de los protoplastosAplicaciones del aislamiento y cultivo de protoplastos9596999.9.1SELECCIÓN IN VITROSelección in vitro de variantes somaclonales101102105BIBLIOGRAFÍA8
LISTA DE FIGURASFigura 1. Busto de Gottlieb Haberlandt en el Laboratorio de Cultivo de Tejidosde la Universidad de Ciencias Agrícolas en Bengaluru, India.Figura 2.Figura 3. Plano del laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Universidadde Córdoba.Figura 4. Crecimiento micelial de hongos en cultivo de tejidos.Figura 5. Esquema del proceso de micropropagación.Figura 6. Estados de establecimiento (A), multiplicación (B), enraizamiento(C) y adaptación ex vitro (D) en la micropropagación de plantasGynerium sagitatum Aubl.).Figura 7. Organogénesis de plantas de tabaco.Figura 8. Inducción (A), multiplicación de tejidos embriogénicos (B) ydesarrollo de enbriones somáticos de ñame (C) Dioscorea sp.Figura 9. Recuperación de una planta de aguacate (Persea americana) apartir de un embrión somático.Figura 10.embriogénicas de aguacate (Suárez, 2003).15252831616667757683LISTA DE TABLASTabla 1.Tabla 2.Formulación de macro y micronutrientes de cuatro medios decultivos.Tiempos de esterilización en autoclave de acuerdo con la cantidadde medio en el recipiente.95154
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PRESENTACIÓNEl cultivo de tejidos vegetales es una técnica biotecnológica que comprendeel mantenimiento de plantas o componentes de estas en condicionesambientales controladas, ausencia de microorganismos asociados, nutriciónmuchos aspectos del desarrollo agrícola y la investigación vegetal.El establecimiento exitoso de plantas, o partes de estas, ha permitidodesarrollar técnicas alternativas de manejo agronómico que hanrevolucionado los sistemas de producción agrícola, y en algunos casosha posibilitado la aplicación de ciertos métodos que sin el desarrollo deprotocolos de cultivo in vitro sería imposible ejecutarlos. La micropropagaciónde plantas permite la propagación clonal masiva de plantas en espaciosreducidos y obteniendo tasas de multiplicación inimaginables bajocondiciones normales de multiplicación de propágulos asexuales, lade producir plantas sanas a partir de material infectado con contaminantessistémicos. El cultivo de protoplastos facilita la inserción de moléculas ocomponentes en el citoplasma celular que son imposibles de introducir entejidos o células intactas. El cultivo de porciones caulinares, células de calloo embriones somáticos facilita el almacenamiento de recursos genéticosde deterioros naturales y amenazas ambientales. Las mismas estrategiasofrecen la posibilidad de convertirse en fuentes alternas de generaciónpor métodos tradicionales de mejoramiento vegetal y la posibilidad deregenerar plantas a partir de células de forma individual es condiciónindispensable para recuperar plantas que se originan por procedimientosde transformación genética.11
El presente texto ofrece una mirada integral de la ciencia del cultivo detejidos vegetales abarcando desde la evolución de las técnicas de lospioneros que iniciaron en ausencia de técnicas asépticas, pasando por lasnecesidades logísticas para su implementación actual, enfatizando en loslas ventajas y limitantes para la aplicación en agricultura, con lo cual esperaconvertirse en una referencia para estudiantes, docentes, empresarios yEL AUTOR12
1. PREHISTORIA E HISTORIA DEL CULTIVO DETEJIDOS VEGETALESaséptico de plantas, o partes de estas, en recipientes de vidriocondiciones controladas de luz y temperatura. Este conjunto detécnicas tuvo el desarrollo mas acelerado hacia mediados del sigloXX como resultado de los trabajos que permitieron el empleo de unagran variedad de medios de cultivo suplementados con hormonasmadres. A pesar de los avances relativamente recientes, las basescientos de años atrás. En esos inicios, los pioneros del cultivo de13
1.1 El primer cultivo de tejidosEl primer reporte conocido de un cultivo de tejidos vegetales fueconsignado por Henri-Louis Duhamel du Monceau, Agrónomo einspector general de la marina francesa (Arditi, 2008). En su larga obra,Du Monceu publicó experimentos relacionados con la circulaciónde savia en las plantas, injertos y cicatrización de heridas. En unade sus anotaciones describe como al remover un pequeño anillode corteza de un Olmo, se observaba el crecimiento de un tejidoamorfo que ayudaba a la cicatrización de la herida. La descripciónque hizo Du Monceau del tejido sería mas tarde entendido como elcallo formado por masas de células indiferenciadas que crecen de1.2 La teoría celular y totipotenciaLos trabajos realizados por Matthias Schleiden relacionados con laobservación microscópica de tejidos vegetales, le permitió formularla teoría celular (Schleiden, 1838). En su tesis, conceptuó que lacélula vegetal constituía la unidad básica, común y estructural detodas las plantas. Posteriormente, Theodor Schwann formularíacelulares en ambos organismos (Schwann, 1939).regenerar otras células e incluso el organismo entero. Este conceptoorientaron todos sus objetivos en la búsqueda de probar la teoría celular.1.3 El primer cultivo in vitroEl primer cultivo de tejidos vegetales utilizando un medio de cultivocomo sustrato y desarrollado dentro de recipientes de vidrio, fue obradel botánico alemán Gottlieb Haberlandt (Gautheret, 1985) (Figura1). El experimento consistió en el aislamiento de células individuales14
de tejidos foliares del parenquima empalizade, seguido delestablecimiento de las mismas en medios de cultivo suplementadoscon glucosa. A pesar de las condiciones tecnológicas de la época,Haberlandt mantuvo sus cultivos libres de contaminación y observóun aumento en el volumen de las células, pero la división de lasmismas no se llevó a cabo y con el tiempo murieron.Figura 1. Busto de Gottlieb Haberlandt en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos dela Universidad de Ciencias Agrícolas en Bengaluru, India.dogmático, Haberlandt humildemente reconoció la selecciónequivocada de sus tejidos (células individuales altamentediferenciadas) y enfatizó en la necesidad de conocer losrequerimientos nutricionales de las células para poder inducir ladivisión y multiplicación de estas.1.4 Crecimiento de tejidos in vitroEl primer avance en la proliferación de tejidos vegetales encondiciones in vitro fue fruto del trabajo de W. J. Robbins y Kotte deforma separada, pero en periodos de tiempo simultáneos (Robbins,Ambos investigadores establecieron meristemos radicales deplantas de maíz en condiciones in vitro, basándose en la posibilidad15
de que los tejidos meristemáticos crecieran con mayor rapidez queotros tejidos. Al principio, los tejidos crecieron en presencia demedios suplementados con extracto de levaduras, glucosa y otrosdisminuyó, se presentó un deterioro progresivo y fenolización queLas evaluaciones posteriores determinaron que la falta detransferencias a medios frescos y el uso de una especiemonocotiledona de naturaleza recalcitrante al cultivo in vitroestablecidos.Tomando como base el trabajo de Robbins y Kotte, Phillip White(White, 1934).Habiendo analizado los reportes de sus antecesores, White cambióde especie y, en lugar de maíz, utilizó meristemos radicales de tomate,de la misma formulación. Esta estrategia le permitió alcanzar el éxitoin vitro con especies monocotiledoneas.Resulta interesante anotar que el trabajo de White en el InstitutoRockefeller consistió en encontrar las condiciones para perpetuarla infección de virus vegetales en tejidos in vitro, lo cual obtuvoexitosamente. Sin embargo, en varias oportunidades notó lapresencia de tejidos sanos obtenidos a partir de otros infectados.Las observaciones más detalladas, le permitieron constatar que alaislar y cultivar solamente la zona meristemática del apice radical,los nuevos tejidos crecían sin la presencia del virus, y para conservarla infección era necesario tomar dicha zona asociada con mayor16
cantidad de tejido proximal (basal). Esta observación fue la basepara explicar mas tarde la técnica de cultivo de meristemos utilizadapara la eliminación de partículas virales y otros patógenos sistémicos.1.6 MicropropagaciónLa primera aplicación comercial de las técnicas de cultivo detejidos resultó de la publicación de Ernest Ball relacionada con lapropagación sostenida de plantas in vitro (Ball, 1946). El trabajoexplantes ideales para desarrollar una planta completa. Este avancevino a convertirse en el método de micropropagación a partir deexplantes con meristemos pre-existentes, el cual es el mas utilizadoen la micropropagación comercial moderna para la producciónmasiva de plantas en condiciones in vitro.de forma independiente y simultanea por Pierre Nobercourt, Philip1939). Nobercourt utilizó explantes consistentes de discos de raícesde zanahoria, mientras que White estableció tejidos originados entumores de un híbrido de Nicotiana glauca x.Además de utilizar explantes de zanahoria, Gauthereth utilizó tejidocambial de diversas especies y observó el dinámico crecimientoy subcultivo de los tejidos adicionó por primera vez una hormonaaislada (ácido indolacético) al medio de cultivo, lo cual incrementóla proliferación del callo inducido e inició una nueva era en el cultivode tejidos vegetales in vitro.1.8 Cultivo de meristemos y Agrobacterium tumefaciensLos avances logrados por White en sus experimentos con raíces detomate, fueron las bases del trabajo realizado por Georges Morel17
quien fue uno de los primeros investigadores en trabajar in vitro conespecies como orquídeas y vid (Morel, 1963).Morel desarrolló los métodos prácticos de aislamiento y cultivo demeristemos apicales para la obtención de plantas sanas a partir dematerial parental infectado con virus, especialmente en orquídeas.Para la época en que se realizaban estos estudios, una enfermedadcaracterizada por la formación de tumores (agallas) en la corona delos tallos, y considerada en su momento un cáncer vegetal, centró laatención de muchos investigadores. Gracias a sus estudios, Morelfue el primero en descubrir la presencia de opinas, unos metabolitossintetizados por Agrobacterium tumefaciens, en los tumoresdesarrollados en las plantas y considerar el término transformaciónpara explicar dicho fenómeno (Petit et al., 1970).1.9 Citocininas y organogénesisLa adición de agua de coco en los medios de cultivo y su efecto enla proliferación de los tejidos vegetales cultivados in vitro, interesó demanera particular a varios investigadores. Inicialmente se demostróel efecto inductor de crecimiento y multiplicación celular de laadenina en los tejidos vitro (Skoog y Tsui, 1948) y posteriormente,fue aislada la kinetina a partir de extractos de levadura sometidos aaltas temperaturas mediante el autoclave (Miller et al., 1955).El aislamiento previo de las auxinas, y ahora de las citocininas, dieron unde auxinas y citocininas en la formación de órganos y crecimiento decallo a partir de cultivos de tabaco (Skoog y Miller, 1957).1.10 Medios de cultivoEl desarrollo de formulaciones que proporcionaran el medio decultivo ideal para el crecimiento de los cultivos aislados y cultivadosen condiciones in vitro fue un tema de gran actividad investigativa a18
partir de la segunda mitad del siglo XX. Esto permitió el desarrollo devarias formulaciones para diferentes propósitos, la mayoría de estasbasadas en cantidades relativamente bajas de sales.Murashige y Skoog (1962) estudiaron de forma detallada losrequerimientos minerales de cultivos celulares de tabaco, obteniendouna formulación con mayores cantidades de sales. El alto contenidode NO3 y NH4 permitió que los tejidos tuvieran tasas de crecimientohasta 25 veces superiores a las obtenidas hasta ese momento conotras formulaciones. En la actualidad, el medio de Murashige y Skooges el más utilizado en el cultivo de tejidos vegetales a nivel mundial.1.11 Embriogénesis somáticaEl primer reporte difundido acerca de la formación de embriones apartir de células somáticas en condiciones in vitro fue publicado porF. C. Steward, en el Congreso Botánico de Kiev en 1958, mostrandola formación de embriones a partir de suspensiones celulares dezanahoria (Steward et al., 1958).La publicación acerca de la embriogénesis somática causó grancontroversia por tratarse de la primera vez que se conocía deldesarrollo de embriones fuera del saco embrionario, consideradocomo el ambiente único para el crecimiento embriogénico.Posteriormente, se pudo comprobar que la formación de embrionessomáticos fuera del saco embrionario había sido previamentelograda por Stevenson (1956) y Mahershwari y Rangaswamy (1956)a partir de tejidos nucelares de cítricos.1.12 Se prueba la teoría celularLa demostración de la teoría celular y el efecto de totipotencia,convertida en casi una obsesión, fue esquiva hasta pasada laprimera mitad del siglo XX.19
La errónea concepción inspirada en los trabajos de Haberlanddonde se consideró la posibilidad de que células aisladas pudierandar origen a una planta completa fue descartada, promoviendoplanta a partir de una célula en particular sin ser necesario que estase encontrara en completo aislamiento. Vasil y Hildebrandt (1965),utilizando células del híbrido Nicotiana glutinosa x Nicotiana tabacum,utilizaron un sistema de separación mediante una membrana queevitaba el contacto directo de la célula individual con un grupode células, sin evitar que los exudados de una y otra entraran encontacto (separación sin aislamiento). Este método determinó queel efecto de vecindad entre las células era determinante y que latotipotencia era una realidad incompatible con el aislamiento celular.20
2. EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALESEl cultivo de tejidos es la parte de la biotecnología aplicada a laen condiciones de estricto control de las condiciones ambientales,por lo que debe desarrollarse en sitios que garanticen ciertascondiciones ambientales denominados laboratorios.El laboratorio de cultivo de tejidos es una localidad en la cual se buscay prevenir la presencia de agentes contaminantes. Adicionalmente,debe estar dotado con una serie de equipos y herramientas para serEl proceso global que se lleva a cabo en un laboratorio de cultivode tejidos consta de una secuencia jerárquica de operaciones queuna de las etapas o fases del mismo. Es por esto, que las áreas osecciones en las cuales se encuentra organizado un laboratorio de21
2.1 Áreas del laboratorioÁrea de direcciónEs el área destinada a la realización de actividades administrativas yacadémicas, donde se encuentran ubicadas preferencialmente laspersonas que dirigen el laboratorio y los investigadores asociados.área experimental, pero no ubicarse dentro de ésta, ya que en algúnmomento es posible contar con la presencia de personal ajeno a lasactividades propias del laboratorio.Área de lavado y limpiezaLa limpieza inadecuada de los recipientes y utensilios, así como laprincipales fuentes de contaminación en las operaciones del cultivode tejidos. Para favorecer una asepsia adecuada, todo laboratorioEl área de lavado y limpieza debe tener paredes y mesas construidascon materiales rígidos y lisos (enchapes, acero, etc.) para prevenir laacumulación de microorganismos, tener un suministro permanentede agua, contar con lavaderos y drenajes, recipientes cerrados parala disposición de desechos, contar con sitios que permitan el secadode la cristalería y demás materiales lavados.Área de preparación de medios de cultivoLa preparación de medios de cultivo requiere del uso de equiposcomo balanzas, platos giratorios y potenciómetros, utensilios comobeakers, tubos de ensayos, espátulas y barras giratorias, e insumoscomo sales, hormonas y reactivos.22
Ciertos equipos, como el potenciómetro, deben ser calibradosdiariamente, y anexo al sitio donde se ubica cada equipo debeencontrarse impreso el protocolo que debe seguirse para su utilizacióny el manual del fabricante para resolver cualquier inquietud. Losutensilios deben mantenerse limpios, guardados en sitios cerradosy ordenados en grupos comunes, mientras que los insumos yreactivos se deben almacenar en sitios cerrados protegidos de lasaltas temperaturas e impermeables a la alta humedad relativa.Es conveniente ubicar los insumos y reactivos en vitrinas cerradas yordenarlos alfabéticamente, teniendo en cuenta que ácidos y baseshigroscópicos deben ubicarse en sitios secos distantes de losdemás productos. Debido a los costos y las cantidades utilizadas,para los compuestos que requieran de refrigeración (reguladoresde crecimiento, antibióticos, etc.) es preferible adquirirlos yalmacenarlos en pequeñas cantidades para evitar pérdidas que sede viabilidad.graves en los procesos, es necesario llevar un registro de inventarioque indique no solamente las cantidades existentes de cada uno delos productos sino también sus características físico químicas y elsitio de almacenamiento.Área de esterilizaciónEsta es el área donde se encuentran los equipos destinados anormalmente la esterilización de medios y utensilios se lleva a caboen autoclaves, que generan altas temperaturas (120 ºC) y presiones(1.1 PSI) que son imposibles de soportar por los organismos vivos,complementado con colocación previa en estufa de secado (1 a 3horas a 200 ºC) de todos los elementos de vidrio y metálicos.23
El área de esterilización debe tener una buena ventilación paracontrarrestar las altas temperaturas generadas por el autoclave, enmovilidad y estar adecuada con mesas construidas con materialesresistentes al calor intenso.La adopción de un plan de mantenimiento preventivo que permitadetectar de forma temprana fallas en conexiones eléctricas, fugasde agua o presión, y deterioro de partes, es indispensable paratener un buen funcionamiento de los equipos y reducir los riesgosde accidentes laborales.Área de producciónEsta es la zona del laboratorio donde se llevan a cabo las labores deestablecimiento de explantes y subcultivos que tienen como objetivola multiplicación de plantas o tejidos vegetales.Las tasas de producción en cultivo de tejidos son una resultante desuministro de un medio de cultivo adecuado durante los estados deestablecimiento y multiplicación, y la presencia de un ambiente librede contaminantes. Para cumplir con este último requerimiento, ellas cuales proveen un ambiente de trabajo limpio como resultado delabores normales y rutinarias que se desarrollan en el área productiva,como son la apertura de recipientes, transferencias a medios frescosy manipulación directa de los tejidos, son las que presentan el mayorriesgo de contaminación el material vegetal in vitro. Es por esto queel área de producción debe ser una de las secciones con la mayorrestricción para el tránsito de personas ajenas a las actividades quese realizan en esta área, y donde los protocolos de las técnicasestériles deben seguirse más estrictamente para lograr un buenfuncionamiento.24
Figura 2.El área de producción también debe estar dotada con recipientespara el depósito de desechos, sitios para colocar de formacultivos, instalaciones eléctricas que permitan uso de equipos comodesplazamiento y la rápida evacuación.Área de crecimientoEs el área destinada a permitir el crecimiento y desarrollo de lostejidos después de haber sido establecidos en los medios de cultivo.Una vez subcultivado, el material vegetal debe ser colocado encondiciones ideales de luz y temperatura proporcionadas porsistemas controlados de iluminación y aire acondicionado. A pesarde que los cultivos en período de crecimiento deben ser disturbadoslo menos posible, es preciso realizar monitoreos permanentes conevitar la diseminación de microbios, por lo que el diseño de estaárea debe garantizar el fácil desplazamiento del personal.25
2.2 Medidas de seguridadUn laboratorio de cultivo de tejidos, además de ser un sitio diseñadopara el manejo de componentes vegetales in vitro y la generaciónde nuevos conocimientos, es a la vez un sitio donde se encuentrandepositados equipos que funcionan con altas temperaturas y altasrepresentan grandes riegos para el funcionamiento y la salud humana.Para disminuir los riegos de accidentes y facilitar la evacuación encaso de presentarse alguna emergencia, se deben tomar las debidassino también una rápida evacuación por parte del personal que en élse desempeña. Para cumplir con este propósito, las áreas de trabajoy operaciones deben diseñarse de tal forma que permitan procesoscontinuos con el menor grado de interferencia posible.Como medida de seguridad importante, cada área del laboratoriodebe contar con al menos dos vías de salida para el personal. Lassalidas de emergencia deben estar debidamente señalizadas yser construidas en materiales que permitan su visualización aún enausencia de luz.Todo laboratorio debe contar con kits de primeros auxilios y extintoresde incendios. Para cada equipo se debe colocar en forma escrita, yclaramente visible, el protocolo de manejo, disponer de canecas dedeposición de residuos en sitios estratégicos, almacenar los vidriosrotos y materiales cortantes en recipientes separados y debidamenterotulados, y realizar mantenimientos preventivos periódicos a losequipos.En horas no laborales, se deben mantener apagadas las luces yequipos que no se encuentren en uso, y es preciso para el buenfuncionamiento del laboratorio, restringir la entrada y circulación depersonas ajenas a las actividades del mismo.26
2.3 Equipos, utensilios y reactivos básicos necesariosEquipos:- Autoclave- Horno microondas- Estufa de secado- Medidor de pH- Plato giratorioReactivos:- Sales minerales- Reguladores decrecimiento- Ácidos- Bases- Agentes gelatinizantes- Vitaminas- Azucares- Reguladores osmóticos- Antibióticos- Hormonas- Micropipetas- Balanzas- Termómetro- Microscopio- Agitador orbital- Medidor de humedadrelativa- Aire acondicionadoUtensilios:- Cristalería- Pinzas quirúrgicas- Espátulas- Guantes- Barras magnéticas- Soportes- Marcadores- Bisturís- Cuchillos- Tabla de cortar- Tijeras27
28Área deestudioAlmacénÁrea de biologíamolecularFigura 3. Plano del laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Universidad de Córdoba.Área administrativaÁrea depreparaciónde mediosy esterilizaciónÁrea decrecimientoÁrea de crecimientoÁrea de producción
3. TÉCNICA ESTERIL EN CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALESy desarrollo de los cultivos vegetales en condiciones in vitro.Las condiciones del ambiente en el que se encuentran los cultivos,como son los altos niveles de humedad relativa dentro del recipiente,fácil disponibilidad de nutrientes en el medio, ausencia de agentesuna mínima cantidad de agentes contaminantes puede terminarcausando la pérdida parcial o total del tejido vegetal cultivado.Aunque las contaminaciones por microbios pueden aparecer encualquier fase del proceso de cultivo de tejidos, estas son maspuede detectarse en varios días e incluso meses después del29
3.1 Tipos de contaminantes en el cultivo in vitroLas plantas en su condición de crecimiento natural tienen asociadasasociados al sistema vascular de la planta. Sin embargo, en condicionesde cultivo in vitro, estos microbios se convierten en contaminantes oagentes facilitadores de contaminación para los explantes.Dentro de los organismos contaminantes más comunmente asociadoscon los cultivos in vitro se encuentran las bacterias, los hongos, losBacteriasSon los mas comunes entre los microbios contaminantes de tejidosvegetales en condiciones in vitro. Algunos de los géneros de bacteriasvitropatógenas con mayor incidencia son Acinbacter, Agrobacterium,Bacillus, Corynebacterium, Erwinia, Enterobacter, Lactobacillus,Pseudomonas, Staphyllococcus y Xantomona (Agrios, 2005).Los síntomas más comunes de la contaminación bacterial en lostejidos vegetales son la muerte completa del explante, crecimientodesuniforme, necrosis localizadas, bajas tasas de multiplicación enbrotes axilares y baja capacidad de enraizamiento. Generalmente,de manchas de aspecto acuoso y coloración variada en el tejidovegetal, turbidez en medios líquidos y por la presencia de coloniasque crecen en forma circular sobre medios semisólidos.HongosLos hongos son microorganismos que generalmente actúan comocontaminantes externos de los explantes, aunque algunos seencuentran asociados con el sistema vascular.30
Los géneros más comunes de hongos que actúan como contaminantesde cultivos in vitro son Aspergillus, Candida, Cladosporium,Penicillium y Saccharomyces, este último conocido como levaduras.Sus contaminaciones se caracterizan por el crecimiento micelial querápidamente cubre el explante resultando en la muerte rápida de lostejidos, aunque la presencia de levaduras puede confundirse concontaminaciones de tipo bacterial (Carlile et al., 2001) (Figura 3).Figura 4. Crecimiento micelial de hongos en cultivo de tejidos.que pueden causar enfermedades en organismos vegetales. Lasrickettsias se caracterizan por ser inmóviles, mientras que lospatógenos externos o sistémicos, y son generalmente inoculados enla planta por insectos vectores (Agrios, 2005).tejidos vegetales in vitro son amarillamiento de las hojas, reducción31
Virus y viroidesson pequeñas cadenas de ARN sin proteínas asociadas que puedencausar enfermedades en las plantas. Ambos se desplazan dentro delas plantas a través de los conductos vasculares y necesitan de unacélula hospedera para llevar a cabo sus funciones básicas (Suárezy Jaraba, 2004).Las contaminaciones ocasionadas por estos microorganismos noy los síntomas más comunes de estas son hojas amarillentas,presencia de mosaicos en la lámina foliar, crecimiento lento y bajacapacidad de enraizamiento.ArtrópodosVarios arácnidos, como los ácaros y trips, e insectos, como lashormigas, pueden llegar a convertirse en problemas para elmantenimiento de las condiciones de asepsia en los cultivos detejidos in vitro (Matthews, 1981).Los ácaros son transportados por el viento y fácilmente introducidosen el laboratorio a través de los sistemas de aire acondicionado,mientras que la presencia de comida y desechos orgánicos en ellaboratorio favorece la presencia de hormigas. Tanto los ácaroscomo las hormigas actúan como transportadores de esporas dehongos hacia el interior de los cultivos in vitro.3.2 Fuentes de contaminaciónLas fuentes de contaminación son aquellas que sirven como vehículopara que los agentes contaminantes lleguen al cultivo in vitro, siendolas más frecuentes el material vegetal, el aire y el operario.Material vegetalplantas sin afectar su crecimiento y desarrollo, e incluso en algunos32
casos favoreciendo el desempeño vegetal. Sin embargo, una vez encontacto con las condiciones in vitro se convierten en vitropatógenos.La mayoría de los microorganismos se localizan en pequeñascavidades de la corteza de los tallos y órganos donde se hacemás difícil la penetración de las soluciones desinfectantes yconsecuentemente su eliminación. Adicionalmente, algunas plantastienen microbios asociados a su sistema vascular, que hacen aúnmás complicado el proceso de desinfestación.AireEl aire en condiciones normales mantiene suspendidas partículasde polvo, esporas de hongos, bacterias, ácaros y otros agentespresencia de estos factores al interior de los cultivos, es necesariocontar con un mecanismo que proporcione una buena calidad delaire para disminuir los riesgos por contaminación.Trabajador u operariopueden llegar a contaminar los cultivos in vitro. Adicionalmente, elproceso de renovación de la piel hace que del cuerpo humano sedesprendan células muertas que pueden llevar consigo agentesexternos, los cuales al entrar en contacto con el cultivo in vitrodesarrollan contaminaciones.La indebida realización de las manipulaciones es una segundaforma mediante la cual el operario puede actuar como una fuentede contaminación. Dentro de las fallas más comunes se encuentranla utilización de utensilios contaminados, vociferación durante larealización de subcultivos, indebida colocació
1.3 El primer cultivo in vitro El primer cultivo de tejidos vegetales utilizando un medio de cultivo como sustrato y desarrollado dentro de recipientes de vidrio, fue obra del botánico alemán Gottlieb Haberlandt (Gautheret, 1985) (Figura 1). El experimento consistió en el aislamiento de células individuales
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